實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制和滅菌

實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配制和滅菌第1頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。

了解幾種滅菌方法，重點(diǎn)掌握高壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。第2頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基本原理培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才能表現(xiàn)它們最大生命力，因此不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)到一定pH值范圍。培養(yǎng)基種類很多，不同的微生物所需培養(yǎng)基不同。按其組成可分合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。按其物理狀態(tài)可分固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。按其特殊用途可分加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制后還必須進(jìn)行滅菌。滅菌和消毒是二個(gè)不同含義的名詞。消毒是指消滅病原菌或有害微生物，而滅菌則是殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物。消毒與滅菌的方法很多，但總的可分為物理法與化學(xué)法兩大類。物理法包括加熱滅菌（干熱滅菌與濕熱滅菌），過濾滅菌、紫外線滅菌等?；瘜W(xué)方法主要是利用有機(jī)或無機(jī)的化學(xué)藥品對實(shí)驗(yàn)室用具和其它物體表面進(jìn)行滅菌與消毒。

第3頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)分組與任務(wù)整個(gè)班分10個(gè)組，一排為一組，每組六人第1-2組：配制200ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第3-4組：配制200ml葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第5-6組：

配制200ml乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第7-8組：

配制150ml明膠培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第9-10組：配制300ml淀粉培養(yǎng)基。用兩個(gè)三角瓶裝好第4頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方（見實(shí)驗(yàn)課本214頁）2、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方（見實(shí)驗(yàn)課本217頁）3、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方（見實(shí)驗(yàn)課本217頁）4、明膠培養(yǎng)基配方（見實(shí)驗(yàn)課本217頁）5、淀粉培養(yǎng)基配方（見實(shí)驗(yàn)課本217頁）四、各培養(yǎng)基的配方第5頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）、培養(yǎng)基的配制：同學(xué)們先將試管貼好標(biāo)簽。注明培養(yǎng)基名稱，日期。標(biāo)簽粘貼位置在離管口1/3管身處。

注意：標(biāo)簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時(shí)蒸汽模糊字跡

操作圖示：第6頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月3．注意事項(xiàng)：在配制培養(yǎng)基時(shí)一定要注意調(diào)溶液的pH。稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。在燒杯融化瓊脂的過程中，人要在電爐旁看著，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出燒杯。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。注意帶上棉紗手套防止?fàn)C傷。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第8頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮紙，便可滅菌。滅菌的時(shí)間和溫度按各培養(yǎng)基規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，可放在37恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，無菌者方可使用。在實(shí)驗(yàn)室里用得最多的加熱滅菌法是高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌。一般培養(yǎng)基和滅菌水等用高壓蒸汽滅菌，而玻璃器皿常用干熱滅菌。蒸汽滅菌為105-121℃，15-20分鐘，干熱滅菌為160-170℃，1-2小時(shí)。目的都是使細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。

在同一溫度下，濕熱殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時(shí)濕熱穿透力強(qiáng)，而且當(dāng)蒸汽與被滅菌物體接觸凝成水分時(shí)，又可放出熱量，使溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容第9頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容高壓蒸汽滅菌法其步驟如下：

1.滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將包扎好的物品放入其中。

2.接通電源，進(jìn)行加熱

3.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)再打開排氣閥，待壓力回復(fù)到0時(shí)再關(guān)閉排氣閥。

4.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2時(shí)，此時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度為121℃，維持30min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長時(shí)間。

5.滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品第10頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題：培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?

在培養(yǎng)基配制操作過程中應(yīng)注意什么問題?為什么?

培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?

高壓蒸汽滅菌前為什么要將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡?

玻璃器皿為什么在滅菌前要先行干燥?

加熱蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌所要求的溫度低、時(shí)間短？第11頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)

大分子物質(zhì)的水解實(shí)驗(yàn)

及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)第12頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.證明不同的微生物對各種有機(jī)大分子的水解能力的不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進(jìn)行微生物大分子水解實(shí)驗(yàn)的原理和方法3.了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用4.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法第13頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理微生物代謝與其他生物代謝有著許多相似之處，也有不同之處。微生物代謝重要特征之一，就是代謝類型的多樣性，因此使得微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用，同時(shí)也為人類開發(fā)利用微生物資源提供更多的機(jī)會與途徑。人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生理生化反應(yīng)作用作為重要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分別安排微生物對生物大分子的分解利用（淀粉水解實(shí)驗(yàn)水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)），對含碳化合物的分解利用（糖發(fā)酵試驗(yàn)）讓同學(xué)們對微生物的代謝類型多樣性有一個(gè)初步和感性的了解，同時(shí)學(xué)習(xí)利用微生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生化反應(yīng)的特征對某些細(xì)菌進(jìn)行初步的分類。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)平板接種法、穿刺接種法、液體接種法。第14頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)材料

1．培養(yǎng)基：淀粉水解培養(yǎng)基：2皿明膠液化培養(yǎng)基：2支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：3支2.接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機(jī)，標(biāo)簽貼紙，廢物杯，紙巾，油性筆。3.實(shí)驗(yàn)菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌第15頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容試驗(yàn)名稱培養(yǎng)基名稱接種菌名稱接種方式每組個(gè)數(shù)淀粉水解淀粉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌/大腸桿菌

平板2明膠水解明膠培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌/大腸桿菌穿刺2葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌和變形桿菌液體3乳糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌和變形桿菌液體3第16頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50℃，無菌操作制成平板（2）用記號筆在平皿背面劃成兩部分。（3）將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌分別在不同的部分劃線接種，并在平板的反面分別記下兩部分的菌名。（3）將接完種的平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。（4）觀察結(jié)果時(shí)，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，是碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱，即產(chǎn)生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有無透明圈）操作步驟：1.淀粉水解試驗(yàn)：（2皿）第17頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）取兩支明膠培養(yǎng)基試管，用記號筆標(biāo)明各管欲接種菌的菌名。（2）用接種針分別以穿刺接種法接種枯草芽孢桿菌和大腸桿菌于對應(yīng)的明膠培養(yǎng)基中。（2）接種后置于20℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2-5d。（3）觀察結(jié)果時(shí)，注意培養(yǎng)基有無液化現(xiàn)象。（以“+”、“－”表示有無液化現(xiàn)象）注意：如果細(xì)菌在20℃時(shí)不能生長，則必須培養(yǎng)在所需的最適溫度下，觀察結(jié)果時(shí)需將試管從恒溫箱里取出，置于冰浴中，才能觀察液化程度。2.明膠液化試驗(yàn)：第18頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）用記號筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名。（2）取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，以液體接種的方式分別接種變形桿菌和大腸桿菌，第三支不接種，作為對照。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，同樣分別接入變形桿菌和大腸桿菌，第三支不接種，作為對照。接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小試管進(jìn)入氣泡。（3）將接種過和作為對照的6支試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。（4）觀察結(jié)果時(shí)，看各管顏色變化及杜氏小管有無氣泡。3.糖類發(fā)酵試驗(yàn)：第19頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月圖糖類發(fā)酵試驗(yàn)

第20頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告菌名淀粉水解試驗(yàn)明膠液化試驗(yàn)枯