PCR基因擴(kuò)增儀課件

PCR基因擴(kuò)增儀

(PCRGeneAmplifier)

1ppt課件.PCR基因擴(kuò)增儀

內(nèi)容提要1.PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR技術(shù)的原理及發(fā)展PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理2.PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)定性PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀3.PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、操作規(guī)程

PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程4.PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用2ppt課件.內(nèi)容提要1.PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理2ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展Khorana(1971)等最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可合成tRNA基因?！?985年，KaryMullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開(kāi)車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號(hào)4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人；1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第一篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開(kāi)始學(xué)習(xí)PCR的方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。3ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理一、PCR技術(shù)的發(fā)展聚第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理二、PCR技術(shù)的原理體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，PCR儀就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。4ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理二、PCR技術(shù)的原理4p第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；DNA模板與引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍5ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理模板DNA的變性：模板D第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。從PCR反應(yīng)基本原理可以看出，PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。6ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理PCR基因擴(kuò)增儀的工作關(guān)第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理7ppt課件.第一節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理7ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)8ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)8ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針熒光信號(hào)的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析9ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)熒光實(shí)時(shí)定量PCR（rea第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀

離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀

各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀10ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀金屬第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀

可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無(wú)需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致11ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀12ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)ABI7500熒光定量P第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀溫度均一性較好使用的是同一個(gè)激發(fā)光源和檢測(cè)器，隨時(shí)檢測(cè)旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能13ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀1第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

14ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)Rotor-Gene30第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀不同樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測(cè)。SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺(tái)儀器同時(shí)操作六個(gè)樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運(yùn)用，還可實(shí)現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。SmartCyclerⅡ上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨(dú)特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。15ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀16ppt課件.第二節(jié)PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)SmartCyclerⅡ熒第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程及常見(jiàn)故障的排除

一、PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)17ppt課件.第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程及常見(jiàn)故障的排除（二）熒光檢測(cè)系統(tǒng)

激發(fā)光源

檢測(cè)器

發(fā)光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管18ppt課件.（二）熒光檢測(cè)系統(tǒng)激發(fā)光源檢測(cè)器發(fā)光二極管鹵鎢燈光源第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程（三）軟件簡(jiǎn)便的人性化設(shè)計(jì)最能滿足其需求。新型的PCR儀很注重程序編寫(xiě)的簡(jiǎn)易性，易學(xué)易用具有實(shí)時(shí)信息顯示、記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)倒記時(shí)、自動(dòng)斷電保護(hù)等功能，很多還可以免費(fèi)升級(jí)。19ppt課件.第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程（三）軟件19（四）其他多樣化樣品基座設(shè)計(jì)、熱蓋等都使PCR儀越來(lái)越人性化。第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程20ppt課件.（四）其他第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程20第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程二、PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡(jiǎn)便，接通電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存的程序運(yùn)行即可。定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。21ppt課件.第三節(jié)PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)、

操作規(guī)程二、PCR擴(kuò)增第四節(jié)PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用三、PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用1.感染性疾病的分子診斷和研究2.遺傳性疾病的分子診斷和