中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)基本技能課件

中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)基本技能中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)基本技能1一、概述分離并鑒定單體化合物是中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)的基本要求，也是進(jìn)一步進(jìn)行其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。主要包括分離和鑒定兩個(gè)步驟。常說(shuō)的過(guò)柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠、樹脂、凝膠或氧化鋁作固定相的吸附或分配色譜柱。由于柱分的經(jīng)驗(yàn)成分太多，所以下面我就幾年來(lái)過(guò)柱的體會(huì)寫些心得，希望能有所幫助。一、概述分離并鑒定單體化合物是中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)的基本要求，也是2二、柱層析分離1、柱子可以分為：加壓，常壓，減壓壓力可以增加淋洗劑的流動(dòng)速度，減少產(chǎn)品收集的時(shí)間，但是會(huì)減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時(shí)候，常壓柱是效率最高的，但是時(shí)間也最長(zhǎng)，比如天然化合物的分離，一個(gè)柱子幾個(gè)月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺(jué)能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過(guò)硅膠會(huì)使溶劑揮發(fā)（有時(shí)在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時(shí)使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時(shí)間長(zhǎng)）。以前曾經(jīng)用過(guò)減壓柱但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒(méi)動(dòng)過(guò)減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過(guò)外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過(guò)大，不然溶劑走的太快就會(huì)減低分離效果。本人覺(jué)得加壓柱在普通的有機(jī)化合物的分離中是比較適用的。二、柱層析分離1、柱子可以分為：加壓，常壓，減壓32、關(guān)于柱子的尺寸應(yīng)該是粗長(zhǎng)的最好柱子長(zhǎng)了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點(diǎn)就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^?。?，這樣相對(duì)的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當(dāng)然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過(guò)這些成本相對(duì)于產(chǎn)品來(lái)說(shuō)也許就不算什么了?，F(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10。書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺(jué)得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。

2、關(guān)于柱子的尺寸43、關(guān)于濕法、干法上樣

濕法上樣省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒(méi)關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會(huì)析出，這一般都是比較大量的樣品才會(huì)出現(xiàn)，是因?yàn)楣枘z對(duì)樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會(huì)發(fā)生，這就應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶那就不管它了，直接過(guò)就是了，樣品隨著淋洗劑流動(dòng)會(huì)溶解的。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會(huì)隨著溶劑一起走，顯色是一個(gè)很長(zhǎng)的脫尾），這時(shí)就必須用干法上柱了。3、關(guān)于濕法、干法上樣

5干法上樣：樣品和硅膠的量有一種說(shuō)法是1：1，我覺(jué)得是越少越好，但是要保證在旋干后，不能看到明顯的固體顆粒（那說(shuō)明有的樣品沒(méi)有吸附在硅膠上）。干法上樣溶劑的選擇，（最便宜，最安全，最環(huán)保）。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻(xiàn)中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要，因?yàn)槠錁O性很小，有時(shí)還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺(jué)，注意保持清醒別讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程，所以夏天的時(shí)候經(jīng)常會(huì)在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時(shí)候會(huì)好一些。甲醇，據(jù)說(shuō)能溶解部分的硅膠，所以產(chǎn)品如果想過(guò)元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過(guò)后繼處理，比如說(shuō)重結(jié)晶、過(guò)SephadexLH-20柱等。其他的溶劑用的相對(duì)較少，要依個(gè)人的不同需要選擇了。干法上樣：樣品和硅膠的量有一種說(shuō)法是1：1，我覺(jué)得是越少越好6由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的，如10升或25升塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經(jīng)常能夠從送來(lái)的大桶底部看見有色的雜質(zhì)，其他的雜質(zhì)就可想而知了，所以在比較嚴(yán)格的柱分時(shí)就要對(duì)溶劑重蒸。當(dāng)然過(guò)原料時(shí)就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過(guò)柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費(fèi)，缺點(diǎn)是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過(guò)柱同時(shí)進(jìn)行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會(huì)導(dǎo)致極性的變化，一般會(huì)使得極性變大，在梯度淋洗時(shí)比較合適，正好極性越來(lái)越大了。在過(guò)完柱子后，溶劑最后回收要采用常壓，因?yàn)樵跍p壓旋蒸時(shí)會(huì)有部分低沸點(diǎn)的雜質(zhì)一起出來(lái)，常壓時(shí)就會(huì)減少這種現(xiàn)象。由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的，如10升或25升塑料74、關(guān)于操作問(wèn)題。4.1裝柱。柱子下面的活塞一定不要涂潤(rùn)滑劑，會(huì)被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。干法和濕法裝柱覺(jué)得沒(méi)什么區(qū)別，只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會(huì)從一側(cè)斜著下來(lái)）。在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒(méi)太大的影響，一加壓氣泡就全下來(lái)了。當(dāng)然如果你裝的柱子總是有氣泡就說(shuō)明需要多練習(xí)了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會(huì)影響分離效果，甚至作廢！4、關(guān)于操作問(wèn)題。84.2加樣用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開；待溶劑層下降至柱床表面時(shí)，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次；加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2～4cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。4.2加樣94.3淋洗劑的選擇。使所需點(diǎn)在rf0.2～0.3左右的比較好。不要認(rèn)為在板上爬高了分的比較開，過(guò)柱子就用那種極性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因?yàn)橹邮且粋€(gè)多次爬板的狀態(tài)，可以通過(guò)公式的比較：0.6/0.8一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。

4.3淋洗劑的選擇。104.4樣品的收集。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個(gè)樣品。如果都用小試管那工作量又太大。4.5后處理柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質(zhì)也會(huì)累積到產(chǎn)品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶劑洗滌一下，因?yàn)榇蟛糠值碾s質(zhì)是溶在溶劑里的，一洗基本就沒(méi)了，必要時(shí)進(jìn)行重結(jié)晶。

另外，再過(guò)柱的時(shí)候，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)氣泡，一是和使用的溶劑有關(guān)，如果是易揮發(fā)的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在室溫稍高的情況下，很容易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，在室溫高的時(shí)候，可以選擇沸點(diǎn)較高，揮發(fā)相對(duì)小的溶劑。還有，使用混合溶劑時(shí)，使用的兩種溶劑的沸點(diǎn)應(yīng)該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚卻要選擇30－60的石油醚。不論是用帶砂板的還是塞棉花的，在裝柱之前，都要將空氣用加壓的方法將空氣排干，這樣就可避免柱中有空氣！過(guò)柱子需要耐心，不要著急。

中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)基本技能課件11三、組分及化合物的編號(hào)LeavesfromLinderaaggregataExtract.(500g)PEExtr.EtOAcExtr.BuOHExtr.ExtractwithPE,EtoAC,andBuOHFr.PE-A,B,C……Fr.EA-A,B,C……Fr.BT-A,B,C……LAZ-PE-1,2,3LAZ-EA-1,2,3LAZ-BT-1,2,3三、組分及化合物的編號(hào)LeavesfromPEExtr.12四、化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)測(cè)定的順序參考文獻(xiàn)——TLC檢測(cè)——1H-NMR——參考文獻(xiàn)——13C-NMR——1H-1HCOSY——HSQC，HMBC——MS——NOESY——X-ray——CACOSY1H-NMRHMBCHSQC13C-NMRDEPTNOESYSampleMS四、化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)測(cè)定的順序COSY1H-NMRHMBC13天然藥物結(jié)構(gòu)測(cè)定中常用的手段UVIR1D-NMRMSCDORD2D-NMRX-ray平面結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)天然藥物結(jié)構(gòu)測(cè)定中常用的手段UVIR14天然藥物結(jié)構(gòu)測(cè)定中常用的順序5-10mg氘代試劑1H-NMRMS13C-NMRESI-MSEI-MS2D-NMR1H-1HCOSYHSQCHMBCDEPT查新IRUVHR-EIMSNOESYX-ray天然藥物結(jié)構(gòu)測(cè)定中常用的順序5-10mg氘代試劑1H-NMR15信號(hào)的靈敏度增高信號(hào)與信號(hào)間的分離度改善信號(hào)的圖形趨于簡(jiǎn)單化

不同分辨率的1H-NMR的區(qū)別信號(hào)的靈敏度增高不同分辨率的1H-NMR的區(qū)別16不同溶劑的信號(hào)峰，及峰形不同不同溶劑中的水峰位置不同同一質(zhì)子的信號(hào)在不同溶劑中的位置不同

氘代溶劑的裂分取決于氘代氫核的數(shù)目，即2n1經(jīng)驗(yàn)規(guī)律:萜類,甾體(CDCl3,C5D5N);黃酮（DMSO-d6)香豆素，苯丙素等(CD3OD,CD3COCD3)溶劑位移不同溶劑的信號(hào)峰，及峰形不同溶劑位移17也叫質(zhì)子去偶譜，測(cè)定該譜時(shí)去偶器的頻率覆蓋了全部質(zhì)子的共振頻率，故使所有1H對(duì)13C核的偶合影響全部消除，每個(gè)不等價(jià)的碳核在圖譜上均表現(xiàn)為一個(gè)單峰。另外，由于照射同碳上的質(zhì)子所產(chǎn)生的增益效應(yīng)，導(dǎo)致13C核的信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，提高信噪比。伯，仲，叔碳的信號(hào)強(qiáng)度不同(與各個(gè)碳的縱向馳豫時(shí)間有關(guān))噪音去偶譜也叫質(zhì)子去偶譜，測(cè)定該譜時(shí)去偶器的頻率覆蓋了18中藥化學(xué)的實(shí)驗(yàn)基本技能課件19DEPT譜DEPT譜201H-H相關(guān)譜對(duì)角峰與相關(guān)峰偕偶，鄰偶，烯丙偶合，W型偶合二維FT-NMR1H-H相關(guān)譜二維FT-NMR212.C-H相關(guān)譜(HMQC)相關(guān)峰2.C-H相關(guān)譜(HMQC)22HMBCSpectrumofCompound7(CDCl3,500MHz)OHH-1H-93.

C-H遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)相關(guān)峰HMBCSpectrumofCompound7(C234.H-H遠(yuǎn)程相關(guān)譜(NOESY)相關(guān)峰與對(duì)角峰4.H-H遠(yuǎn)程相關(guān)譜(NOESY)243-hydroxy-8-oxo-eremophila-6,9-dien-12-oicacid3-hydroxy-8-oxo-eremophila-625實(shí)例實(shí)例26H2O峰氘代