第七章-微生物的遺傳和變異課件

第七章微生物遺傳和變異通過本章的學(xué)習(xí)，要求掌握：1、細(xì)菌基因重組的原理和方法。2、基因工程的基本原理重點：細(xì)菌的基因重組微生物是遺傳學(xué)研究中的明星

微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。物種和代謝類型多樣對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。遺傳性：生物的親代傳遞給其子代一套遺傳信息的特性；遺傳型：生物體所攜帶的全部基因總稱；表型：具有一定遺傳型的個體，在特定的外界環(huán)境中，通過生長和發(fā)育所表現(xiàn)出來的種種形態(tài)和生理特征的總和；變異：指生物體在某種內(nèi)因或外因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變；飾變：同種遺傳型的生物，在不同的外界條件下，會呈現(xiàn)不同的表型。第一節(jié)生物遺傳信息的載體①1928年，F(xiàn).Griffith；1944年O.T.Avery肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）轉(zhuǎn)化試驗。②1952年，A.D.Hershy、M.Chase的噬菌體感染實驗。③1956年，H.Fraenkel-Conrat的TMV拆開和重建實驗。一、證明核酸是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實驗1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗——1928年，F(xiàn).Griffth肺炎鏈球菌：S型（菌體具莢膜，菌落表面光滑，有致病能力）

R型（菌體無莢膜，菌落表面粗糙，無致病能力）①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長出S菌只有R菌1944年Avery、MacLeod和McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗：只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子DNA。2、噬菌體感染實驗——1952年，A.D.Hershy、M.Chase3、植物TMV重組實驗——證明RNA是TMV的遺傳物質(zhì)二、微生物基因組原核生物染色體真核生物染色體外遺傳成分質(zhì)粒細(xì)胞器轉(zhuǎn)座因子插入序列（IS）轉(zhuǎn)座子（Tn）某些病毒（Mu噬菌體）轉(zhuǎn)座因子：細(xì)胞中能改變自身位置（例如從染色體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一個位點，或者在兩個復(fù)制子之間轉(zhuǎn)移）的一段DNA序列。也稱跳躍基因或可移動基因。插入序列：能在染色體上和質(zhì)粒的許多位點上插入并改換位點，也稱跳躍基因。

轉(zhuǎn)座子：能插入染色體或質(zhì)粒不同位點的一般DNA序列，具有轉(zhuǎn)座功能，本身也可復(fù)制。轉(zhuǎn)座后在原來位置仍保留1份拷貝。

某些病毒：能自我復(fù)制，也可整合到染色體或質(zhì)粒上，且可在微生物細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移而可看作為一類微生物染色體外的遺傳物質(zhì)。

一切具有自主復(fù)制能力的遺傳功能單位都稱為基因。它的物質(zhì)基礎(chǔ)是一個具有特定核苷酸順序的DNA片段。

結(jié)構(gòu)基因：是為細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組成(如細(xì)胞生化反應(yīng)所需的酶)及完成細(xì)胞功能所需的蛋白質(zhì)等進(jìn)行編碼的基因。調(diào)節(jié)基因：用于編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因。操縱基因：是位于啟動基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能與調(diào)節(jié)蛋白相結(jié)合，以此來決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄是否能進(jìn)行。重復(fù)基因：DNA片段重復(fù)跳躍基因：可在DNA上轉(zhuǎn)移位置的基因（IS因子、Tn因子）乳糖操縱子調(diào)控模型信息大分子及遺傳信息流第二節(jié)細(xì)菌的基因重組基因重組generecombination兩個不同來源的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換，經(jīng)過基因的重新組合，形成新的基因型的過程。重組獲得的后代具有新的基因組合，表現(xiàn)出不同于親本的新性狀。原核微生物沒有有性生殖，其基因重組通過轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行。一、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：指外源DNA（人工合成的或者從供體細(xì)胞中提取的）不經(jīng)任何媒介被直接吸收到受體細(xì)胞的過程。這些被轉(zhuǎn)化的游離的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。

供體菌受體菌DNA片段轉(zhuǎn)化需要的條件：

1、感受態(tài)細(xì)胞：受體菌最容易接受外源DNA片段并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)稱為感受態(tài)

2、外源游離DNA分子轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)化的特點：不需兩個細(xì)胞直接接觸，供體DNA提取出來，注入受體即可。噬菌體DNA被感受態(tài)細(xì)胞攝取并產(chǎn)生有活性的病毒顆粒轉(zhuǎn)染(transfection)：轉(zhuǎn)染的特點：提純的噬菌體DNA以轉(zhuǎn)化的（而非感染）途徑進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)后產(chǎn)生完整的病毒顆粒。人工轉(zhuǎn)化：在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項細(xì)菌基因重組手段，不是由細(xì)菌自身的基因所控制，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。二、轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指通過噬菌體介導(dǎo)的DNA在不同細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移和基因重組的現(xiàn)象。細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型：普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)完全轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體：能將細(xì)菌宿主的部分染色體和質(zhì)粒DNA帶到另一個細(xì)菌的噬菌體。獲得了由噬菌體攜帶來的供體菌DNA片段的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。在轉(zhuǎn)導(dǎo)中被轉(zhuǎn)移的染色體片段稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行誤包，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)完全轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行整合、重組和復(fù)制，也不迅速消失，而是表現(xiàn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)。因此群體中僅一個細(xì)胞含有DNA，而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物。流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特有基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：指通過一般溶源菌釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因其只能形成極少數(shù)的轉(zhuǎn)導(dǎo)子而得名。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：在局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中，若對雙重溶源菌進(jìn)行誘導(dǎo)，就會產(chǎn)生含50%左右的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用這種裂解物去轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌，就可獲得高達(dá)50%左右的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物正常噬菌體極少量的部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒高感染復(fù)數(shù)雙重溶源菌缺陷噬菌體和正常噬菌體同步復(fù)制高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物部分缺陷噬菌（局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體）正常噬菌體等量轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子（大量）三、接合接合：是指通過兩種細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸而將DNA從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌,并使后者獲得新遺傳性狀的現(xiàn)象。1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.TatumE.coli

k12的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗中間平板上長出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致。接合機(jī)制(大腸桿菌的接合機(jī)制)接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)。F因子的分子量通常為5×107，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛及控制接合過程進(jìn)行的20多個基因。F因子特點：1）可經(jīng)接合作用而獲得；2）可通過一些理化因素的處理，而從細(xì)胞中消失；3）在大腸桿菌中，F(xiàn)因子的DNA含量約占總?cè)旧w含量的2%。F因子的四種細(xì)胞形式：a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)，F(xiàn)因子獨立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。F’菌株當(dāng)Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離其染色體組時，可形成游離的攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱F’因子。攜帶有F’因子的菌株，其性狀介于F+與Hfr之間，這就是初生F’菌株。初生F’菌株與F-菌株接合，可使后者轉(zhuǎn)變成F’菌株，這就是次生F’菌株，它既獲得了F因子，又獲得了來自初生F’菌株的若干遺傳性狀。以這種接合來傳遞供體菌基因的方式，稱為F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-duction)、性導(dǎo)(sexduction)

。在次生的F’群體中，大約有10%的F’因子重新整合到染色體組上，而恢復(fù)成Hfr菌。四、原生質(zhì)體融合將遺傳性狀不同的兩種菌的（包括種間、種內(nèi)、及屬間）原生質(zhì)體融合成為一個新的重組子的技術(shù)。原生質(zhì)體融合步驟：1、原生質(zhì)體制備2、原生質(zhì)體融合和再生3、融合子的選擇第三節(jié)重組DNA技術(shù)基因工程：在基因水平上，改造遺傳物質(zhì)，即將分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀?？寺≥d體（cloningvector）：負(fù)責(zé)將外源DNA片段運送到細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease

）：是指能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割DNA的一類核酸內(nèi)切酶。一、基因工程微生物在基因工程中的作用：

1.微生物作為克隆載體:質(zhì)粒、病毒、噬菌體

2.微生物生產(chǎn)基因工程工具酶；

1)、限制性核酸內(nèi)切酶

2)、DNA連接酶

3.微生物作為克隆載體的宿主；

1)、原核生物宿主：大腸桿菌，枯草芽孢桿菌

2)、真核生物宿主：釀酒酵母

4.微生物作為基因產(chǎn)物的重要表達(dá)載體。

5.理論基礎(chǔ)（主要來自對微生物的研究）；

6.微生物的多樣性提供了豐富而獨特的基因資源。獲得目的基因選擇基因載體體外重組外源基因?qū)耄?xì)菌、植物、動物、基因槍）篩選和鑒定應(yīng)用基因工程的基本操作結(jié)核分枝桿菌H37RV基因組pncAPCR擴(kuò)增Nde

I和Xho

I雙酶切T4DNA連接酶連接基因克?。褐咐肈NA體外重組技術(shù)，將一個特定的基因或者DNA序列插入到一個載體DNA分子上，然后引入適當(dāng)?shù)募闹鬟M(jìn)行擴(kuò)增。AmpAmppncAXho

INde

IOriOriMCS載體大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞AmpCaCl2

或者甘油鈣轉(zhuǎn)化或者電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基克隆子二、基因突變基因突變：一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何可遺傳的改變。基因突變狹義：點突變（一對或少數(shù)幾對堿基的缺失、插入或置換）野生型（原始性狀）基因突變突變型（新性狀）廣義：基因突變和染色體畸變（大片段染色體的缺失、重 復(fù)、倒位）誘變育種：指利用各種誘變劑處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變頻率，通過一定的篩選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。（1）使用簡便有效的誘變劑（2）選用優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液誘變劑物理因素：紫外線、激光、離子束、X射線、r射線等化學(xué)因素：烷化劑、堿基類似物、吖啶化合物微生物誘變育種（4）使用最佳的處理劑量（5）設(shè)計高效率篩選方案誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型鑒定營養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)（抗生素法）影印平板法生長譜法突變株的篩選：產(chǎn)量突變株的篩選抗藥性突變株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選微生物定位誘變采用合成DNA技術(shù)和重組DNA技術(shù)可能在基因的精確位點上引入誘變ACBDPCR1PCR2abcd