桿狀病毒表達系統(tǒng)昆蟲細胞的培養(yǎng)及桿狀病毒滴度測課件

桿狀病毒表達系統(tǒng)(昆蟲細胞的培養(yǎng)及桿狀病毒滴度測定)桿狀病毒表達系統(tǒng)(昆蟲細胞的培養(yǎng)及桿狀病毒滴度測定)1桿狀病毒表達系統(tǒng)昆蟲細胞的培養(yǎng)重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建重組Bacmid的產(chǎn)生與鑒定獲得重組桿狀病毒蛋白表達&病毒擴大2桿狀病毒表達系統(tǒng)昆蟲細胞的培養(yǎng)重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建OverviewBac-to-BacBaculovirusExpressionSystem能快速并有效的獲得重組桿狀病毒，其重組是基于供體質(zhì)粒表達盒與桿狀病毒穿梭載體Bacmid間發(fā)生位點特異性轉(zhuǎn)座。供體質(zhì)粒pFastBac：靶基因位于桿狀病毒特異啟動子下游DH10Bac：桿狀病毒穿梭載體Bacmid+輔助質(zhì)粒3OverviewBac-to-BacBaculovirusBac-to-Bac表達系統(tǒng)的組成和工作原理4Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的組成和工作原理4Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的組成和工作原理5Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的組成和工作原理5Expermiantaloutline6Expermiantaloutline6InsectCellLines：Sf9orSf21cells——主要用于轉(zhuǎn)染，空斑實驗和滴度測定HighFive?cellsorMimic?Sf9cells——轉(zhuǎn)染效率低，主要用于蛋白表達Grace'sInsectMediumwithL-glutamineandsupplementedwith（pH6.5）：

3330mg/Llactalbuminhydrolysate

3330mg/Lyeastolate350mg/LNaHCO3

10%heat-inactivatedfetalbovineserum昆蟲細胞的培養(yǎng)7InsectCellLines：Sf9orSf21Atmosphere：air,100%pipettingacrossthemonolayerscrapingcellscrapershittingtheflaskagainstthepalmofyourhandTemperature：27.0—28.0℃Subculturing：Preservation：90%serum,10%DMSO嚴格程序降溫，-80℃過夜后轉(zhuǎn)移液氮保存。昆蟲細胞的培養(yǎng)8Atmosphere：air,100%pipetting大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜9大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜9重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建選擇合適的載體

10重組pFastBac質(zhì)粒的構(gòu)建選擇合適的載體10重組Bacmid的產(chǎn)生11重組Bacmid的產(chǎn)生11重組Bacmid的鑒定PCR法:pUC/M13ForwardandReverseprimer

或者pUC/M13ForwardorReverseprimerandaprimerthathybridizeswithinyourinsertBacmidDNA≥135kb12重組Bacmid的鑒定PCR法:pUC/M13Forw獲得重組桿狀病毒——轉(zhuǎn)染Sf9cells1.小提好的BacmidDNA，置4℃不超過1周2.

轉(zhuǎn)染試劑：Cellfectin?ⅡReagent3.

轉(zhuǎn)染后細胞的形態(tài)變化細胞變大增殖明顯變慢或不增殖裂解脫落融合(VSV/G)或4.

收毒，短期內(nèi)4℃避光保存，長期保存分裝后置-80℃13獲得重組桿狀病毒——轉(zhuǎn)染Sf9cells1.小提好的Ba病毒擴增&蛋白表達

擴增病毒：接毒量為0.05—0.1MOI一般情況下，P1代毒滴度大概為1×106—1×107PFU/ml，P2代毒滴度1×107—1×108PFU/ml比如：P1代毒滴度為5×106PFU/ml，T75細胞瓶的細胞量2×107cells，那么蛋白表達：接毒量為1—5MOI14病毒擴增&蛋白表達擴增病毒：接毒量為0.05—0.1M桿狀病毒滴度測定兩種病毒滴度測定方法的比較：空斑實驗法測定滴度依賴于病毒在感染細胞中的復制以及感染周邊細胞形成局灶型病變；而免疫染色法只需要病毒感染靶細胞并表達病毒所編碼的蛋白。因此，免疫染色法（infectiousunitsperml,orIFU/ml）測定病毒滴度需要的時間比空斑法（PFU/ml）更短。15桿狀病毒滴度測定兩種病毒滴度測定方法的比較：空斑實驗法測定滴BacPAK?RapidTiterKit

本測定方法，以針對桿狀病毒囊膜蛋白gp64的單克隆抗體標記被病毒感染的細胞，然后以HRP-標記的二抗與感染細胞進行染色。通過底物顯色，在光學顯微鏡下計數(shù)感染斑點的數(shù)量，經(jīng)過稀釋倍數(shù)的換算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。16BacPAK?RapidTiterKit1717注意事項：

細胞鋪板5×106cells/well，細胞計數(shù)要準，臺盼藍染色，保證細胞活力≥

95%。2.病毒稀釋要準，不同濃度之間換槍頭，是確保不同稀釋度孔斑點成10倍關(guān)系的關(guān)鍵。3.整個過程中，輕輕洗板，避免細胞脫落過多。4.實驗完畢3h后數(shù)斑，效果更佳。5.結(jié)果判定：18注意事項：細胞鋪板5×106cells/well，細胞疫苗免疫動物后免疫效力評價體液免疫檢測ELISA抗體中和抗體細胞免疫檢測細胞因子mRNA水平檢測—qPCR細胞因子蛋白質(zhì)水平檢測—ELISA淋巴增殖實驗—MTT法19疫苗免疫動物后免疫效力評價體液免疫檢測ELISA抗體中和抗體ELISA抗體

制備良好的抗原包被ELISA板—純化的蛋白或病毒3.設(shè)置空白孔（不加血清），統(tǒng)計結(jié)果時，所有實驗組的

OD值先減掉背景值，再計算比值和滴度。（1）蛋白質(zhì)與酶標板的結(jié)合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白質(zhì)疏水鍵的適當暴露。（2）酶標板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H鍵，包被液PH大于蛋白PI，使蛋白質(zhì)帶上負電荷，有利于蛋白質(zhì)與酶標板的牢固結(jié)合，提高包被效率。每次包被板子條件一致，4℃16-18h。2.血清樣品不溶血，防止干擾結(jié)果。方陣滴度確定最佳抗原包被濃度。20ELISA抗體制備良好的抗原包被ELISA板—純化的蛋白或微量中和實驗技術(shù)中和抗體21微量中和實驗技術(shù)中和抗體21中和實驗原理22中和實驗原理22分類固定病毒—稀釋血清法固定血清—稀釋病毒法（用的很少）用途疾病診斷病毒分離株的鑒定不同病毒株的抗原關(guān)系研究疫苗免疫原性的評免疫血清的質(zhì)量評價測定實驗動物血清中是否存在抗體23分類固定病毒—稀釋血清法用途疾病診斷23材料

病毒（1）凍存的病毒不能重復使用（2）進行中和實驗前，需先進行病毒滴定（TCID50）的滴定進行病毒定量2.血清樣品（1）血清樣品分裝凍存于-20℃，一般不要反復凍融3次以上。（2）血清樣品不溶血，不長期凍存，以減少對細胞的毒性。（3）需要有陽性和陰性對照血清，實驗前需56℃滅活30分鐘。3.細胞和細胞培養(yǎng)試劑（1）對數(shù)生長期細胞（2）DMEM/血清/胰酶/抗生素24材料病毒（1）凍存的病毒不能重復使用2.血清樣品（1）固定病毒—稀釋血清法

將不同稀釋度的血清與固定量的?。?00TCID50、EID50或LD50）混合，適當?shù)臈l件下感作一定時間以后，再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游?，測定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锇l(fā)生病毒感染的能力及其效價。以能保護50%組織培養(yǎng)細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锊话l(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(PD50)。25固定病毒—稀釋血清法將不同稀釋度的血2626將96孔細胞培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min—60min。感作完成后每孔加入100μl細胞懸液，繼續(xù)置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察4-5天。結(jié)果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進行。27將96孔細胞培養(yǎng)板放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用452828距離比例=(高于50%的保護率-50%)/(高于50%的保護率-低于50%的保護率)=(66.7-50)/(66.7-16.7)=0.33

PD50=-1.299的反對數(shù)=0.05=1/20即1:20稀釋的待檢血清可保護50%的組織培養(yǎng)細胞不出現(xiàn)CPE中和效價(PD50)的計算：lgPD50=高于50%保護率的血清稀釋度的對數(shù)

+距離比例×稀釋度對數(shù)的差

=-1.2+0.33×(-0.3)=-1.29929距離比例=(高于50%的保護率-50%)/(高于50%的保固定血清—稀釋病毒法

在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清（對照組）和待檢血清同時進行測定，計算每一組的TCID50、EID50或LD50，然后計算中和指數(shù)。30固定血清—稀釋病毒法在固定量的血清中3131注意事項：

待檢血清需56℃滅活30分鐘。需重復測定抗體時，血清應分裝后凍存，以免反復凍融。細胞應處于對數(shù)生長期，嚴禁細胞過度生長或老化，細胞活力≥95%。4.牛血清有中和病毒感染力的作用，實驗過程中切勿將細胞培養(yǎng)液與病毒稀釋液混淆使用。5.病毒與抗血清混合，常規(guī)采用37℃作用1小時。但針對不同耐熱性的病毒，孵育溫度和時間應有所增減。6.每份血清做3個生物學重復。32注意事項：待檢血清需56℃滅活30分鐘。32細胞免疫的檢測首先要完成淋巴的分離和體外刺激包括脾淋巴細胞/外周血單核細胞的分離

33細胞免疫的檢測首先要完成淋巴的分離和體外刺激33脾細胞的分離：

2.將脾臟轉(zhuǎn)入勻漿器中，加少量不完全1640，輕輕研磨。1.處死的小鼠經(jīng)消毒后，放置于泡沫板右側(cè)臥固定，剪開左側(cè)背腹交界處皮膚，分三套鑷子/剪刀無菌取脾臟3.靜置，吸上清液入15ml離心管中，1000rpm×10min。4.棄上清，加入5ml的8.3g/lNH4Cl，靜止5min(去除紅細胞)，1000rpm×10min。5.棄上清，用不完全RPMI-1640洗滌，1000rpm×10min。6.細胞計數(shù)，臺盼藍染色，要求細胞活性應在95%以上。7.調(diào)整濃度為4×106cells/ml。34脾細胞的分離：2.將脾臟轉(zhuǎn)入勻漿器中，加少量不完全1640外周血單核細胞的分離

：

35外周血單核細胞的分離：35細胞因子的定量PCR檢測：

（1）于24孔板中加入適量的相關(guān)刺激原（basedoninvitrodose-responsestudies），然后將濃度為4×106cells/ml的細胞懸液加至各孔內(nèi)，每孔1ml。（2）置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)20h，提取細胞總RNA并測定RNA濃度和純度。（3）取0.5μgRNA進行逆轉(zhuǎn)錄（TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑）。（4）定量PCR：36細胞因子的定量PCR檢測：（1）于24孔板中加入適量的相關(guān)細胞因子的ELISA檢測：

（1）于24孔板中加入適量的相關(guān)刺激原（basedoninvitrodose-responsestudies），然后將濃度為4×106cells/ml的細胞懸液加至各孔內(nèi)，每孔1ml。（2）置37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)72h后，收取細胞上清。（3）詳細閱讀說明書的實驗步