分子生物學載體

分子生物學載體第1頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月

載體（Vectors）在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。載體是DNA雙鏈分子。載體DNA分子中是有一段生長擴增的非必需區(qū)，該區(qū)經人工改造后可插入外源的DNA，并可轉入宿主細胞中，使外源DNA與載體DNA共同擴增。第2頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能1.為外源基因提供轉入受體細胞的轉移能力；2.為外源基因提供在受體細胞中的復制或整合能力；3.為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達提供必要的條件能力。第3頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月理想載體至少必備的條件①

能在宿主細胞中自主復制②

容易進入宿主細胞③

容易插入外來核酸片段④容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作⑤具有合適的篩選標記⑥具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）第4頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月目前的主要載體質粒（Plasmid）單鏈DNA噬菌體M13噬菌體的衍生物柯斯質粒（Cosmid）動物病毒（virus）細菌人工染色體(BAC)酵母人工染色體(YAC)

第5頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的質粒第7頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月獨立于染色體以外的能自主復制、并能被穩(wěn)定遺傳的一類雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。分子量：1--300kb。編碼基因少：2—3個中等大小的蛋白質。如：抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。

質粒（plasmid）第8頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒DNA的空間構型?SC構型:兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結構，DNA呈現(xiàn)超螺旋。?OC構型:兩條鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結構，另一條鏈出現(xiàn)缺口，稱之為開環(huán)DNA。?L構型:DNA雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分子。第9頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月質?？臻g構型與電泳速率分子量相同的，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第10頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1質粒的生物學基本特性

1.自主復制性

攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori），它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制。質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。第11頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.生物不相容性（Incompatibility）有時不同的質粒可同時共存在于一個細菌內，但同群質粒（不同的，但親緣性高）不能共存于同一細胞，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性。同群質粒含有相似復制子結構的不同質粒。以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容質粒的生物學基本特性第12頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒的不相容性分子機制

兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內。兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。第13頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月3.可轉移性部分質粒含有tra基因，指令宿主細胞產生菌毛，合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞接合，導致遺傳物質從一細胞轉移至另一細胞中。4.穩(wěn)定性質粒在宿主細胞中保持著一定的拷貝數(shù)。5.寄生性質粒只能在宿主的細胞內復制。6.可擴增性質粒的生物學基本特性第14頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月7.攜帶特殊的遺傳標記

野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性：重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成：抗生素、細菌毒素、有機堿等。這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。

質粒的生物學基本特性

第15頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2質粒的類型（1）按轉移性分革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|粒

能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等非接合型質粒

非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。第16頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2質粒的類型（2）按復制機理分：嚴緊控制型質粒，松弛控制型質粒。嚴緊型復制質粒（stringentplasmid）嚴緊型質粒的復制受到宿主細胞蛋白質合成的嚴格控制，復制隨細菌染色體的復制同步進行。特點：拷貝數(shù)少，只有1-3

拷貝（接合型質粒分子量大，一般屬嚴緊型）。松弛型復制質粒（relaxedplasmid）松弛型質粒的復制不受宿主細胞蛋白質合成的嚴格控制，獨立于細菌細胞而自主復制。特點：拷貝數(shù)多，通常有幾十乃至幾千份拷貝（非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。作為載體的質粒應該是松弛型的第17頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3質粒的命名用小寫字母p代表質粒，在p字母后面用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質粒的作者或實驗室名稱。后面的數(shù)字是構建質粒的編號。如：pUC18和pBR322。第18頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月天然質粒的局限性（1）分子量大，拷貝數(shù)低，單一酶切位點少（2）篩選標志不理想質粒載體必須具備的基本條件（1）具有復制起點（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因——是篩選的標志理想的載體應該有兩種抗菌素抗性基因。（3）若干限制性內切酶的單一位點：用來插入外源DNA片段，且插入后不影響復制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（5）易從宿主細胞中分離純化。1.4質粒載體的構建第19頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月加入合適的選擇標記基因，通常是抗生素基因。增加或減少合適的酶切位點，便于重組。縮短長度，切去不必要的片段，增加裝載量。改變復制子，由嚴緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。加裝特殊的基因元件。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數(shù)幾個野生型質粒構建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE1

6.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內毒素標記基因E1RSF2124

ColE1衍生質粒氨芐青霉素抗性標記基因Apr1.4質粒載體的構建第20頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月人工構建的質粒載體的類型（1）高拷貝數(shù)的質粒載體

適合大量增殖克隆基因、或需要表達大量的基因產物。（2）低拷貝數(shù)的質粒載體不適合大量擴增DNA用。

但有特殊用途。（3）溫控的質粒載體（runawayplasmidvectors）這是一類溫度敏感型復制控制質粒。溫度低（低于37℃），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40℃）時，拷貝數(shù)會很快增加到1000個以上。第21頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）插入失活型質粒載體載體的克隆位點位于其某一個選擇性標記基因內部?？咕乜剐酝庠碊NA無抗菌素抗性第22頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）正選擇的質粒載體（Directselectionvectors）直接選擇轉化后的細胞。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。目前通用的絕大部分質粒載體都是正選擇載體。（6）表達型質粒載體主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。第23頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因的整合。穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因能在兩種不同的受體細胞中復制。探針質粒篩選克隆或尋找基因元件。第24頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質粒圖譜1.首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）2.再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

（1）Ampr

水解β－內酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）Tetr可以阻止四環(huán)素進入細胞。

（3）Camr生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（Kanr）氨基糖苷磷酸轉移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活

（5）Hygr使潮霉素β失活。

第25頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質粒圖譜3.看多克隆位點（MCS）。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

4.再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。

第26頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質粒圖譜5.是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。第27頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月

UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于

1978年，在pBR322的基礎上改造而成，如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

2.8kb元件來源①復制起點：pBR322的ori②Ampr基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位點。③lacZ’基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。在lacZ基因中有一段人工合成的含多種內切酶的單一切點，在此位點上插入外源DNA都能滅活下游lacZ基因。

用于基因克隆和測序1.5經典的大腸桿菌質粒載體--pUC系列第28頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆位點：10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。選擇標記：Ampicillin抗性和lacZ的肽互補（藍白斑）相結合。第30頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖第31頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第33頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月異丙基-β-D-硫代半乳糖苷第36頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第40頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體（Bacteriophage）噬菌體是一類細菌病毒，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。

結構：蛋白質外殼內包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。2噬菌體載體2.1噬菌體的一般特性第41頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月T4Bacteriophage第42頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第43頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2.1溶菌周期——烈性噬菌體（virulentphage)感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。2.2.2溶原周期——溫和噬菌體（temperatephage)感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化（lysogenization)。原噬菌體（prophage)：整合到細菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細菌的染色體復制而復制。2.2噬菌體的生活周期（有兩種）第44頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第46頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月

單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd噬菌體。M13噬菌體2.3單鏈噬菌體載體第47頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3.1單鏈DNA噬菌體的特點

+DNA（ssDNA）。復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。

RFDNA和ssDNA都能轉染感受態(tài)大腸桿菌，并產生噬菌斑。不存在包裝限制?？僧a生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。第48頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3.2M13噬菌體

寄主：大腸桿菌。

DNA長度：6407bp。

外型:絲狀

組成:由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

基因:至少有10個基因

DNA提純：RFdsDNA在寄主細胞內以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。

M13噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長第49頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月RFDNA:replicationalformDNA優(yōu)點：第51頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月RF-DNA(復制型DNA)+DNA轉譯與包裝相關的蛋白質RFDNA達到200個拷貝時,+DNA被單鏈特異的DNA結合蛋白結合,阻斷-DNA的復制只能以-DNA為模板復制新的+DNA新的+DNA立即被積累在細胞內的殼蛋白包裝成新的噬菌體顆粒,不斷被擠出宿主細胞第52頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月M13DNA載體的構建：包裝極限可達M13DNA本身長度的7倍第53頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月M13系列載體的優(yōu)點有MCS，便于克隆不同的酶切片段

Xgal顯色反應，可供直接選擇無包裝限制，克隆能力大可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。第54頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.1

λ噬菌體的生物學特性：生物結構λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈，稱為cos區(qū)。λ-DNAλ-DNA上至少有61個基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞，DNA自主復制以及調控基因，中間是負責與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因。2.4雙鏈噬菌體載體——載體第55頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA進入細菌體內后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復制型（RFDNA）。第56頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第57頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第58頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月genome(48502bp)第60頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.3

噬菌體載體的構建

野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長度，可以提高裝載量。野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。構建原理：刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。①在這個非必須區(qū)內制造限制酶切點②引進某些突變表型，作為選擇標記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點——噬菌體DNA上本身有5個EcoRI和7個HindIII切點！根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA分成兩大類載體：

插入型載體取代型載體第62頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月插入型載體長度36.4kb插入片斷長度：0-14.5kb（36.4-51.9kb〕第63頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第65頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第66頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月替換型λ-DNA載體長度26kb插入片斷長度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb〕第67頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。2.4.5載體的體外包裝

第69頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月

載體的體外包裝

第70頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝存在的問題①包裝錯誤：既能包裝內源性原DNA，也能包裝重組的

DNA載體。②重組：外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內源性原DNA發(fā)生重組。③體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%~105%（36—51kb）之間，即既不能超過正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%。

注：野生型DNA的必須區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（一般為15kb）。第71頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細胞內進行DNA的裝配過程第72頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒密度已達1013

-1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放λ-DNA乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA第73頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月2.4.7λ-DNA載體的優(yōu)點λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡便λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，常用于構建基因文庫，但不適合表達外源基因第74頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月3cosmid載體（粘粒）

1978年，J.Collins和B.Hohn等人發(fā)展出

cosmidvector（cossite-carryingplasmid)大?。?-8kb組成DNA：cos序列和控制包裝的序列。pBR322：質粒的復制子抗藥性基因幾個限制性酶的單一位點裝載范圍為31-45kb多用于基因文庫構建第75頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月cos:cohesive-endsite特點：第76頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月第77頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月考斯質粒的構建

?由于λ-DNA包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順序cos區(qū)。將這段DNA與質粒連在一起，構建的重組質粒，可裝載外源DNA（45.5kb)，它仍可象λ-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進入細胞后，要通過質粒上的復制子進行復制。第78頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月cosmidvector的特點

①具有噬菌體的特性在寄主細胞內形成環(huán)化DNA

不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

克隆后可以體外包裝成噬菌體顆粒。②具有質粒載體的特性能象質粒一樣復制。③方便的選擇有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。④高容量的克隆能力45kb（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb第79頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多單個基因也相當大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構建的一些載體：BAC，PI，YAC等。4

人造染色體載體第80頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：

細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體第81頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點：能攜帶大片段DNA，約300kb。在每個細胞中，一個載體分子能繁殖多個拷貝，高產DNA。缺點：會出現(xiàn)插入片段在結構上的不穩(wěn)定，導致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點，人們采用低拷貝數(shù)復制子載體，如，Ecoli中的F因子。此質粒含有2種基因（partA,partB）。每個Ecoli能接受>300kbDNA片段。細菌人造染色體

（BacterialArtificialChromosomesBAC）第82頁，課件共93頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌人造染色體

（BacterialArtificialChromosomesBAC）細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在