分子生物學(xué)載體

分子生物學(xué)載體第1頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

載體（Vectors）在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。載體是DNA雙鏈分子。載體DNA分子中是有一段生長(zhǎng)擴(kuò)增的非必需區(qū)，該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的DNA，并可轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，使外源DNA與載體DNA共同擴(kuò)增。第2頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能1.為外源基因提供轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力；2.為外源基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制或整合能力；3.為外源基因提供在受體細(xì)胞中的擴(kuò)增和表達(dá)提供必要的條件能力。第3頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月理想載體至少必備的條件①

能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制②

容易進(jìn)入宿主細(xì)胞③

容易插入外來(lái)核酸片段④容易從宿主細(xì)胞中分離純化，便于重組操作⑤具有合適的篩選標(biāo)記⑥具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）第4頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前的主要載體質(zhì)粒（Plasmid）單鏈DNA噬菌體M13噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（Cosmid）動(dòng)物病毒（virus）細(xì)菌人工染色體(BAC)酵母人工染色體(YAC)

第5頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第6頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的質(zhì)粒第7頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制、并能被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。分子量：1--300kb。編碼基因少：2—3個(gè)中等大小的蛋白質(zhì)。如：抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細(xì)菌一些額外的特性（非必須）。環(huán)形狀：雙鏈環(huán)狀DNA。

質(zhì)粒（plasmid）第8頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的空間構(gòu)型?SC構(gòu)型:兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，DNA呈現(xiàn)超螺旋。?OC構(gòu)型:兩條鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)缺口，稱(chēng)之為開(kāi)環(huán)DNA。?L構(gòu)型:DNA雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線性分子。第9頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率分子量相同的，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第10頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.1質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性

1.自主復(fù)制性

攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori），它能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制。質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。第11頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.生物不相容性（Incompatibility）有時(shí)不同的質(zhì)?？赏瑫r(shí)共存在于一個(gè)細(xì)菌內(nèi)，但同群質(zhì)粒（不同的，但親緣性高）不能共存于同一細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱(chēng)為質(zhì)粒的不相容性。同群質(zhì)粒含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒。以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性第12頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的不相容性分子機(jī)制

兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。第13頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.可轉(zhuǎn)移性部分質(zhì)粒含有tra基因，指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛，合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞接合，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)從一細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞中。4.穩(wěn)定性質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中保持著一定的拷貝數(shù)。5.寄生性質(zhì)粒只能在宿主的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。6.可擴(kuò)增性質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性第14頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性：重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成：抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿等。這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。

質(zhì)粒的生物學(xué)基本特性

第15頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2質(zhì)粒的類(lèi)型（1）按轉(zhuǎn)移性分革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢?lèi)：接合型質(zhì)粒

能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合型質(zhì)粒

非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定。第16頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.2質(zhì)粒的類(lèi)型（2）按復(fù)制機(jī)理分：嚴(yán)緊控制型質(zhì)粒，松弛控制型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（stringentplasmid）嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制受到宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，復(fù)制隨細(xì)菌染色體的復(fù)制同步進(jìn)行。特點(diǎn)：拷貝數(shù)少，只有1-3

拷貝（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。松弛型復(fù)制質(zhì)粒（relaxedplasmid）松弛型質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制，獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞而自主復(fù)制。特點(diǎn)：拷貝數(shù)多，通常有幾十乃至幾千份拷貝（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的第17頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.3質(zhì)粒的命名用小寫(xiě)字母p代表質(zhì)粒，在p字母后面用兩個(gè)大寫(xiě)字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)室名稱(chēng)。后面的數(shù)字是構(gòu)建質(zhì)粒的編號(hào)。如：pUC18和pBR322。第18頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月天然質(zhì)粒的局限性（1）分子量大，拷貝數(shù)低，單一酶切位點(diǎn)少（2）篩選標(biāo)志不理想質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因——是篩選的標(biāo)志理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)：用來(lái)插入外源DNA片段，且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（5）易從宿主細(xì)胞中分離純化。1.4質(zhì)粒載體的構(gòu)建第19頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月加入合適的選擇標(biāo)記基因，通常是抗生素基因。增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組?？s短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，增加裝載量。改變復(fù)制子，由嚴(yán)緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。加裝特殊的基因元件。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE1

6.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124

ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr1.4質(zhì)粒載體的構(gòu)建第20頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類(lèi)型（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體不適合大量擴(kuò)增DNA用。

但有特殊用途。（3）溫控的質(zhì)粒載體（runawayplasmidvectors）這是一類(lèi)溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37℃），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40℃）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。第21頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部?？咕乜剐酝庠碊NA無(wú)抗菌素抗性第22頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（5）正選擇的質(zhì)粒載體（Directselectionvectors）直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。（6）表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。第23頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月測(cè)序質(zhì)粒含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因的整合。穿梭質(zhì)粒裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子，便于基因能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制。探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?。?4頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質(zhì)粒圖譜1.首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類(lèi)型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）2.再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

（1）Ampr

水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）Tetr可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

（3）Camr生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

（4）neor（Kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活

（5）Hygr使潮霉素β失活。

第25頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質(zhì)粒圖譜3.看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

4.再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第26頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如何閱讀質(zhì)粒圖譜5.是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。第27頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于

1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成，如pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

2.8kb元件來(lái)源①?gòu)?fù)制起點(diǎn)：pBR322的ori②Ampr基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位點(diǎn)。③lacZ’基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。在lacZ基因中有一段人工合成的含多種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，在此位點(diǎn)上插入外源DNA都能滅活下游lacZ基因。

用于基因克隆和測(cè)序1.5經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體--pUC系列第28頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第29頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月克隆位點(diǎn)：10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。選擇標(biāo)記：Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。第30頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖第31頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第32頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第33頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第34頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第35頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月異丙基-β-D-硫代半乳糖苷第36頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第37頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第38頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第40頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月噬菌體（Bacteriophage）噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病毒，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。

結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。2噬菌體載體2.1噬菌體的一般特性第41頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月T4Bacteriophage第42頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第43頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.2.1溶菌周期——烈性噬菌體（virulentphage)感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。2.2.2溶原周期——溫和噬菌體（temperatephage)感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（lysogenization)。原噬菌體（prophage)：整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱(chēng)為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。2.2噬菌體的生活周期（有兩種）第44頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第45頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第46頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd噬菌體。M13噬菌體2.3單鏈?zhǔn)删w載體第47頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.3.1單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)

+DNA（ssDNA）。復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。

RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑。不存在包裝限制。可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。第48頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.3.2M13噬菌體

寄主：大腸桿菌。

DNA長(zhǎng)度：6407bp。

外型:絲狀

組成:由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

基因:至少有10個(gè)基因

DNA提純：RFdsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。

M13噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)第49頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第50頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RFDNA:replicationalformDNA優(yōu)點(diǎn)：第51頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RF-DNA(復(fù)制型DNA)+DNA轉(zhuǎn)譯與包裝相關(guān)的蛋白質(zhì)RFDNA達(dá)到200個(gè)拷貝時(shí),+DNA被單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合,阻斷-DNA的復(fù)制只能以-DNA為模板復(fù)制新的+DNA新的+DNA立即被積累在細(xì)胞內(nèi)的殼蛋白包裝成新的噬菌體顆粒,不斷被擠出宿主細(xì)胞第52頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13DNA載體的構(gòu)建：包裝極限可達(dá)M13DNA本身長(zhǎng)度的7倍第53頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)有MCS，便于克隆不同的酶切片段

Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇無(wú)包裝限制，克隆能力大可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。第54頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.4.1

λ噬菌體的生物學(xué)特性：生物結(jié)構(gòu)λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λ-DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈，稱(chēng)為cos區(qū)。λ-DNAλ-DNA上至少有61個(gè)基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞，DNA自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負(fù)責(zé)與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因。2.4雙鏈?zhǔn)删w載體——載體第55頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后，可形成雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RFDNA）。第56頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第57頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第58頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第59頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月genome(48502bp)第60頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第61頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.4.3

噬菌體載體的構(gòu)建

野生型λ-DNA包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型λ-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量。野生型λ-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。構(gòu)建原理：刪除噬菌體的非必需區(qū)，留出插入空間。①在這個(gè)非必須區(qū)內(nèi)制造限制酶切點(diǎn)②引進(jìn)某些突變表型，作為選擇標(biāo)記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除DNA必須區(qū)段上常用的限制酶切點(diǎn)——噬菌體DNA上本身有5個(gè)EcoRI和7個(gè)HindIII切點(diǎn)！根據(jù)切除的多少，可將λ-DNA分成兩大類(lèi)載體：

插入型載體取代型載體第62頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月插入型載體長(zhǎng)度36.4kb插入片斷長(zhǎng)度：0-14.5kb（36.4-51.9kb〕第63頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第64頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第65頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第66頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月替換型λ-DNA載體長(zhǎng)度26kb插入片斷長(zhǎng)度：10.4-24.9kb（36.4-51.9kb〕第67頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第68頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月λ-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了λ噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。2.4.5載體的體外包裝

第69頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

載體的體外包裝

第70頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月體外包裝存在的問(wèn)題①包裝錯(cuò)誤：既能包裝內(nèi)源性原DNA，也能包裝重組的

DNA載體。②重組：外源的重組DNA載體被誘發(fā)與內(nèi)源性原DNA發(fā)生重組。③體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%~105%（36—51kb）之間，即既不能超過(guò)正常野生型容量的105%；又不能低于正常野生型容量的75%。

注：野生型DNA的必須區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（一般為15kb）。第71頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以噬菌體為載體進(jìn)行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA的裝配過(guò)程第72頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.4.6λ-DNA及其重組分子的分離純化將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入λ噬菌體或重組λ噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基稀釋?zhuān)^續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá)1013

-1014/L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解超速離心，沉淀噬菌體苯酚抽提，釋放λ-DNA乙醇或異丙醇沉淀λ-DNA第73頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.4.7λ-DNA載體的優(yōu)點(diǎn)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡(jiǎn)便λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，常用于構(gòu)建基因文庫(kù)，但不適合表達(dá)外源基因第74頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3cosmid載體（粘粒）

1978年，J.Collins和B.Hohn等人發(fā)展出

cosmidvector（cossite-carryingplasmid)大小：4-8kb組成DNA：cos序列和控制包裝的序列。pBR322：質(zhì)粒的復(fù)制子抗藥性基因幾個(gè)限制性酶的單一位點(diǎn)裝載范圍為31-45kb多用于基因文庫(kù)構(gòu)建第75頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：第76頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第77頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月考斯質(zhì)粒的構(gòu)建

?由于λ-DNA包裝蛋白只識(shí)別粘性末端的一小段順序cos區(qū)。將這段DNA與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的重組質(zhì)粒，可裝載外源DNA（45.5kb)，它仍可象λ-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進(jìn)入細(xì)胞后，要通過(guò)質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。第78頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月cosmidvector的特點(diǎn)

①具有噬菌體的特性在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA

不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌

克隆后可以體外包裝成噬菌體顆粒。②具有質(zhì)粒載體的特性能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。③方便的選擇有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點(diǎn)。④高容量的克隆能力45kb（最少不能低于30kb）。51kb-5kb=45kb第79頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來(lái)構(gòu)建的一些載體：BAC，PI，YAC等。4

人造染色體載體第80頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：

細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體第81頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：能攜帶大片段DNA，約300kb。在每個(gè)細(xì)胞中，一個(gè)載體分子能繁殖多個(gè)拷貝，高產(chǎn)DNA。缺點(diǎn)：會(huì)出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點(diǎn)，人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，如，Ecoli中的F因子。此質(zhì)粒含有2種基因（partA,partB）。每個(gè)Ecoli能接受>300kbDNA片段。細(xì)菌人造染色體

（BacterialArtificialChromosomesBAC）第82頁(yè)，課件共93頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌人造染色體

（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在