動(dòng)物組織中核酸的提取與鑒定

動(dòng)物組織中核酸的提取與鑒定第1頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟第2頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)原理

動(dòng)物組織細(xì)胞中的核糖核酸(RNA)與脫氧核糖核酸(DNA)大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白?？捎萌却姿岢恋沓龊说鞍?，并用95%乙醇加熱除去附著在沉淀上的脂類雜質(zhì)。然后用10%氯化鈉從核蛋白中分離出核酸(鈉鹽形式)，此核酸鈉鹽，加入乙醇可以被沉淀析出。析出的核酸(DNA與RNA)均由單核苷酸組成，在單核苷酸中含有磷酸、有機(jī)堿(嘌呤與嘧啶)或戊糖(核糖、脫氧核糖)。核酸用硫酸水解后，即可游離出這三類物質(zhì)。用下述方法可分別鑒定出這三類物質(zhì)：

第3頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1．磷酸：用鉬酸銨與之作用可生成磷鉬酸，磷鉬酸可被氨基奈酚磺酸還原形成藍(lán)色鉬藍(lán)。2．嘌呤堿：用硝酸銀與之反應(yīng)生成灰褐色的絮狀嘌呤銀化合物。3．戊糖

(1)核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛與3,5-二羥甲苯縮合而成為一綠色化合物：

(2)脫氧核糖在硫酸作用下生成β,ω-羥基-γ-酮基戊糖，后者與二苯胺作用生成藍(lán)色化合物：第4頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)試劑

1．鉬酸銨試劑：鉬酸銨2.5g溶于20mI蒸餾水中，再加入5mol/L硫酸

30ml，用蒸餾水稀釋1OOml。2．氨基奈酚磺酸：商品氨基奈酚磺酸(1，2，4-Amino-naphtholSulfonicAcid)為暗灰色。用下法提純后使用:在100ml

蒸餾水中(90℃)溶解15g亞硫酸氫鈉及1g亞硫酸鈉，加入1.5g商品氨基奈酚磺酸，攪拌使大部分溶解(僅少量雜質(zhì)不溶解)，趁熱過(guò)濾，再迅速使濾液冷卻。加入lml濃鹽酸，則有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。過(guò)濾并洗滌固體數(shù)次。再用乙醇洗滌直到純白色為止。最后用乙醚洗滌，并將固體放在暗處，使乙醚揮發(fā)。將此提純的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中備用。第5頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月氨基奈酚磺酸溶液配制：取195ml的15%亞硫酸氫鈉溶液(溶液必須透明)加入0.5g提純的氨基奈酚磺酸及20%亞硫酸鈉溶液5ml。并在熱水浴中攪拌使固體溶解(如不能全部溶解，可再加20%亞硫酸鈉溶液，每次數(shù)滴，但加入量以lml為限度)。此為濃溶液。置冰箱可保存2-3周，如顏色變黃時(shí)，須重新配制。臨用前，將上述濃溶液以蒸餾水稀釋10倍。

3、3，5-二羥甲苯溶液取密度1.19的鹽酸100ml，加入六水氯化鐵

100mg及二羥甲苯100mg，混勻溶解后，置于棕色瓶中。此試劑宜在臨用前新配制。市售的3，5-二羥甲苯若不純必須用苯重結(jié)晶一、二次，并用活性碳脫色方可使用。4．二苯胺試劑：取1g純的二苯胺溶于100m1重蒸餾的冰乙酸中(或分析純冰乙酸)，加入2.75ml濃硫酸，搖勻。放在棕色瓶中保存。此試劑需臨用時(shí)配制。5．0.9%Nacl。6．20%三氯醋酸。7．95%乙醇。第6頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟

(一)勻漿制備稱取新鮮豬肝(或大白鼠肝臟)5克，加入等量冰冷的

0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成勻漿后加入剩余部分），及時(shí)剪碎。放人研缽中加入少量石英砂，研磨成勻漿。研磨過(guò)程中，要隨時(shí)將研缽置于冰中冷卻。（勻漿制備一定要在低溫條件下制作，操作要迅速，以避免核酸分解。）第7頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(二)分離提取

1．將勻漿5m1置于離心管內(nèi)，立即加入20%三氯醋酸5ml，用玻棒攪勻，靜3min后，以3000r/min離心l0min。

2．傾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒攪勻。用一個(gè)裝有長(zhǎng)玻璃管的木塞塞緊離心管口，在沸水浴中加熱至沸，回餾

2min。注意乙醇沸騰后將火關(guān)小，以免乙醇蒸氣燃燒。冷卻后2500r/min

離心l0min。（脫脂）

3．傾去上層乙醇。將離心管倒置于濾紙上，使乙醇倒干。沉淀中加入

10%氯化鈉溶液4ml，置沸水浴中加熱8min，并用玻棒攪拌。取出待冷卻以2500r/min離心l0min。

4．將上層清液量取體積后傾人一小燒杯內(nèi)。若不清亮可重復(fù)離心一次。

5．取等量在冰浴中冷卻的95%乙醇（在冰箱中），逐滴加入小燒杯內(nèi)。即可看見白色沉淀析出。靜置l0min后，轉(zhuǎn)人離心管

3000/min，離心10min，即可得核酸的白色鈉鹽沉淀。第8頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）DNA與RNA成分的鑒定

1．磷酸的鑒定取試管2支，按表操作管號(hào)水解液5%硫酸鉬酸銨試劑氨基奈酚磺酸測(cè)定對(duì)照10滴——10滴5滴5滴20滴20滴第9頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．嘌呤堿的鑒定:取試管2艾，按表操作管號(hào)水解液5%硫酸濃氨水

5%AgNO3測(cè)定對(duì)照20滴——20滴數(shù)滴使呈堿性數(shù)滴使呈堿性10滴10滴第10頁(yè)，課件共12頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3．核糖的鑒定取試管2支，按表操作將2支試管放入沸水浴內(nèi)加熱10min管號(hào)水解液5%硫酸3，5二羥甲苯