醫(yī)學課件第一章-血液標本采集和血涂片制備

臨床檢驗基礎血液一般檢驗主講人：宮愛華（大連醫(yī)科大學附屬二院檢驗科）聯(lián)系電話一章血液標本采集

和血涂片制備重點：血標本采集方法和血涂片制備技術難點：各種抗凝劑的優(yōu)缺點和使用選擇第一節(jié)血液標本采集和抗凝劑選擇血標本：全血：血細胞+血漿;臨床血液學檢查，血細胞計數(shù)、分類和形態(tài)學檢查血漿：全血除去血細胞；血漿病理性和生理性化學成分的測定，內分泌激素、凝血因子（鈣除外）、血栓和止血檢查血清：離體后血液自然凝固后析出的液體成分（除纖維蛋白原等凝血因子）；臨床化學和臨床免疫學檢查一、采血方法

靜脈采血法部位：主要是肘靜脈。還可以在：手背、內踝、股靜脈，幼兒可采用頸外靜脈采血采血器材：一次性注射器采血步驟和注意事項：止血帶壓迫時間不能過長；注射器和容器必須干燥采血步驟選擇適宜靜脈，在臂扎上壓脈帶，于穿刺處皮膚做環(huán)形消毒讓病人握拳，使靜脈顯露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使針筒刻度向上，先以約30o角度沿靜脈正面進針，穿過皮膚刺人靜脈腔。見回血后，右手固定注射器，用左手緩緩抽出注射器針栓，至所需血量后，解除壓脈帶，放松拳頭，以消毒棉簽壓住穿刺孔，拔出針頭部位：中指或無名指尖內側、耳垂；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定所用器材：采血針、吸管采血步驟及注意事項：避免交叉應嚴格實行一人一針制；穿刺的深度的適當，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗結果。皮膚采血法（毛細血管采血法）部位：主要是肘靜脈。采血器材：真空采血裝置，頭套式、頭皮靜脈式兩種真空采血法（負壓采血法）采血步驟及注意事項：利用真空貯血管中的負壓原理，自動定量的將血液引入貯血管內；瓶塞穿刺針外具有止血護套，使用時請勿將其取下；采集血樣后，針對有輸液要求的病患者，醫(yī)務人員可將軟座與輸液器相接進行輸液，減少病人的靜脈穿刺次數(shù)；一次性使用，用后銷毀。

既有利于標本的收集運送和保存，又便于防止血液交叉感染，已開始在國內推廣使用。方法學評價靜脈采血皮膚采血真空采血缺點不同抗凝劑的使用，限制了重復實驗；價格高改變血液性質，影易于溶血、凝血響有形成分的形態(tài);和可混入組織液環(huán)境污染優(yōu)點標本代表性大，無價廉、快速、操作減少溶血，操組織液影響，適于簡便，標本可直接作規(guī)范，防止臨床研究，可重復測定交叉感染，保實驗和追加其他實護環(huán)境驗質量控制患者：活動情況、精神狀態(tài)、藥物、年齡、性別標本采集等采血：操作規(guī)范溶血：采集、轉移、保管、分離血標本處理：立即送檢實驗結果分析：藥物、飲食的影響；密切結合臨床二、抗凝劑選擇抗凝：用物理或化學方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固

抗凝劑：能夠阻止血液凝固的物質，稱抗凝劑乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝原理：螯合鈣離子使用方法：15g/L濃度EDTA和血液1：10適用范圍：對血細胞形態(tài)、血小板計數(shù)影響小；影響血小板聚集和白細胞吞噬功能；不適合做凝血象檢驗及血小板功能試驗

草酸鹽（sodiumoxalate）

草酸鈉、草酸鉀、草酸銨原理：草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉淀，從而阻止血液凝固使用方法：草酸鈉0.1mol/L和血液1：9適用范圍：凝血象檢查肝素（heparin）

原理：低濃度時抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之間的作用，加強抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成,還能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子Ⅹ的作用；高濃度時阻斷凝血酶和纖維蛋白的反應適用方法：1g/L濃度的肝素鈉與血液1：10優(yōu)點：抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫適用范圍：紅細胞檢驗（紅細胞計數(shù)、血紅蛋白測定、紅細胞比積）和多種生化分析枸櫞酸鹽（枸櫞酸三鈉）

原理：螯合鈣離子使用方法：配成109mmol/L的濃度和血液1：9106mmol/L的濃度和血液1：4適用范圍：止血學檢驗、血沉、輸血保養(yǎng)液（毒性?。┪锢矸椒鼓摾w維蛋白：將血液注入有玻璃珠的器皿中，轉動，纖維蛋白纏繞凝固于玻璃球，從而防止血成凝塊。適

用于免疫學檢驗和紅斑性狼瘡細胞檢查。血液的貯存

1.血液標本檢驗前的預處理分離血清或血漿預溫血漿或血清分離細胞

冷藏保存:血漿在4℃保存24h后，某些凝血因子活性減少95%。供血細胞分析儀使用的EDTA-k2抗凝全血應保存于室溫，但不宜超過8h，如果在4℃保存可使血小板計數(shù)結果減低。

冷凍保存:要長時間保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶類等，可采取分離血清或血漿后快速深低溫冷凍的方式，冷凍的標本一般應避免反復凍融。

根據(jù)檢驗項目要求有些血液標本要求避光、隔絕空氣等

2.血液標本的保存3.血液標本檢驗后的處理

血源性污染是醫(yī)源性污染的主要來源之一，檢驗后的血液標本處理不當，其危害極大。對于檢驗完畢的血液標本首先要進行高壓滅菌，然后再進行無害化處理。帶有血液的檢驗器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要進行毀形、消毒并進行無害化處理。第二節(jié)血液涂片制備和細胞染色

血涂片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法，臨床上應用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細胞分析儀的廣泛應用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結果的簡易方法。

血涂片的用途：血細胞形態(tài)學檢驗、網(wǎng)織紅、異常寄生蟲檢驗。

一、血液涂片制備將推玻片向1的方向稍抽回，當血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動。圖1-3血涂片制備示意圖（上：側面觀，下：正面觀）

[血涂片質量評價]均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚一張良好血涂片的標準是：厚薄適宜、頭體尾分明、細胞分布均勻、邊緣整齊、兩側及兩頭留有空隙。二、血液細胞染色

染料：生物學染色劑，將生物組織細胞和病原體染色，在顯微鏡下觀察結構。發(fā)色基團和助色基團使生物學染色劑產生顏色和被染組織親合。堿性染料：為陽離子染料，能接受質子，染細胞核的染料。如亞甲藍、天青。酸性染料：為陰離子染料，能釋放質子。主要有熒烷-氧雜蒽染料和偶氮染料兩類，能結合細胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等。復合染料：同時具有陰、陽離子型的染料如瑞氏染料細胞染色原理：一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學現(xiàn)象為依據(jù)物理作用：毛細管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學作用：a.染料的化學成分：助色基團的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細胞內帶負電荷的酸性物質結合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質結合。b.蛋白質的化學性質：蛋白質中的氨基酸含有不同數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時還有其它活性基團。在游離狀態(tài)時，-NH2獲得一個H+變成帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個H+變成帶負電的-COO-。分別與不同染料結合。

c.周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI（pI為等電點），則蛋白質帶正電，結合酸性染料；反之，pH＞pI，則結合堿性染料。細胞染色法的類型

普通染色法：經(jīng)物理和/或化學作用的吸附、結合熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡細胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍等細胞化學染色法：用化學反應顯示細胞內某種成分細胞免疫化學染色法（應用單克隆抗體技術、酶標記技術）

瑞氏染色法[瑞氏染料]由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(methyleneblue,M+)組成有復合染料。亞甲藍為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結構。通常為氯鹽，即氯化美藍。美藍容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍溶解在甲醇中，即瑞氏染料。

[染色原理]細胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用，各種細胞成分化學性質不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質；細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結合，染紫藍色，稱為嗜堿性物質；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結合，染淡紫色，稱為中性物質。

M+CL+Na+E→ME+NaCL美藍伊紅伊紅化美藍（瑞氏染料）

圖1-4瑞氏染色原理示意圖

[PH對細胞染色有影響]

細胞各種成分均為蛋白質，由于蛋白質系兩性電解質，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負電荷增多，易與美藍或天青結合，染色偏藍。因此細胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用玻片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液必須用優(yōu)質甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應近中性，否則可導致各種細胞染色反應異常，以致識別困難，甚至造成錯誤。[試劑]

Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有強大的脫水力，可將細胞固定為一定形態(tài)，并使蛋白質沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結構，增加細胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g,蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。[染色方法]1.用