細(xì)胞培養(yǎng)的流程

細(xì)胞培育的流程，從購置試劑、分裝，到無菌操作、試驗(yàn)、觀看的過程？請教細(xì)胞培育的高手就顯得格外重要且貴重了。細(xì)胞培育包括儀器的清洗、消毒滅菌，試劑的購置、配制、分裝，細(xì)胞的分別，無菌操作，格外嚴(yán)格。你的細(xì)胞培育流程，以便我們寬闊的細(xì)胞培育借以一鑒。于此，我先代表寬闊細(xì)胞培育手感謝各位園丁里的奉獻(xiàn)者！說是不計(jì)其數(shù)了，解決困難消耗了大量地時(shí)間，惋惜呀！養(yǎng)細(xì)胞是一項(xiàng)即有難度又很講究技術(shù)的過程，作起來不易，要真正具體的寫出來示人更難！書上的標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)很多，但作起來每人都有自己的方法，適宜就好。我看還沒有人跟帖，我就先說一點(diǎn)，從最初階段開頭〔自己的做法〕〔一〕儀器的清洗總的分為兩大類：可泡酸的和不行泡酸消毒的。酸指消毒的清潔液〔由濃硫酸、重鉻酸鉀和蒸餾水配置的次強(qiáng)酸液〕可泡酸的主要是玻璃儀器培育細(xì)胞的板子，離心管等塑料器皿。消毒過程：自來水沖洗3-5遍----→超聲波清洗30′----→烘干----→濅入清潔液過夜〔不少于6h〕 →自來水沖洗15－20遍 →蒸餾水洗3-5遍，烘干備用。不行泡酸的主要是膠塞和蓋子慮器等，先在清水中濅泡后沖洗烘干 →2%NaOH濅泡過水漂洗 →烘干備用。裝器具，挺便利的，用前高壓。今日暫說一點(diǎn)，以后有時(shí)機(jī)再續(xù)，望給師弟妹們有所借鑒。斑竹不厚道，現(xiàn)在知道為什么沒往后面連續(xù)么！再說，閱歷何止這些這點(diǎn)......您的帖子我觀察了，您的埋怨我也承受！并且跟您補(bǔ)上一分！不變的！比方：版內(nèi)爭論得很多的東西，重復(fù)發(fā)帖一般不予以加分！您的這個(gè)帖子屬于改范疇！感謝您對細(xì)胞版的支持！假設(shè)有問題可以直接pm我們！再次感謝！再多說點(diǎn)?。『呛墙又f呀，很好，很有幫助，我是手，要多向你學(xué)習(xí)頂一下。我也說說我的一些體會(huì)吧。1、首先說清洗：對于玻璃器皿〔如移液管、蓋玻片之類〕可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。10遍，除去殘留酸液，再用雙蒸水沖洗3-5遍，徹底洗凈后放入不銹鋼筒中，雙層牛皮紙?jiān)?，高壓滅?0min，烘干待用。我們試驗(yàn)室的酸液一般是次強(qiáng)酸液〔120g200mL1000mL〕配液時(shí)要留神燙傷。裝培育基的3-5320min，與其配套的瓶蓋則洗凈后另行包好同時(shí)滅菌、烘干。培育基過濾器滅菌同瓶子，也要在用完后準(zhǔn)時(shí)洗凈、滅菌時(shí)保持密封。Tip頭就簡潔了，插到盒子里，雙層牛皮紙包好后直接高壓滅菌就好了。2、再說說除菌：我說的除菌主要是指溶液的除菌。如PBSHEPES之類的一些緩沖劑和不含葡萄糖的鹽溶G-418溶液、各類培育基、各類生長因子、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等.3、關(guān)于各類溶液的配制：我列出我們試驗(yàn)室常用試劑的配方吧：1XPBS80.21.150.2克，加水至一升，調(diào)pH=7.4。這里我認(rèn)為PBS的pH是最重要的一環(huán)，不行大意。HEPES0.30.13515克HEPES900ml，調(diào)pH=7.4抗生素：我們主要用青霉素和鏈霉素，一般用1XPBS稀釋至1X105單位，-20度儲存，用時(shí)直接參加培育基，工作濃度一般為1X102單位。G-418：1克包裝的G-41810mlHEPESEP管，-20度保存。谷氨酰胺：L-29.2Hanks‘BBS1000ml200mmol/L過濾除菌，41～4mmol/L42周以上時(shí)，應(yīng)重參加原來的谷氨酰胺。1XEDTA-胰酶：0.250.1EDTA500ml1XPBS中，過濾除菌后分50ml離心管中，一管4度備用，其他-20度保存。我不太主見配成10X的母液，由于胰酶反復(fù)凍融后，效果會(huì)差很多〔EDTA很難溶，必要時(shí)候可放置過夜〕MTT：sigma公司出產(chǎn)，用1XPBS50mg/ml待用。MTT毒性很大，配置時(shí)務(wù)必留神。GIBICO分溶解，避開局部pH偏高或偏低。再一個(gè)就是水的使用，一般配鹽溶液，用三蒸水即可，而配制培育基務(wù)必用超純水，并在使用前要高壓滅菌。今日太晚了，先說到這，明天連續(xù)4、關(guān)于培育基的選用：我養(yǎng)過的細(xì)胞株不多，權(quán)當(dāng)拋磚引玉吧。一般來說大局部細(xì)胞系我們都用高糖DMEM+10%FCS培育，我們試驗(yàn)室用該培育基的有：SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS，293細(xì)胞則用MEM+熱滅活的馬血清。對于貼壁不是很緊的細(xì)胞，用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~現(xiàn)附上前輩總結(jié)的帖子，期望對大家有幫助5、操作中的一些小細(xì)節(jié)：3070%ethanol擦拭無菌操70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)5分鐘以上后，再進(jìn)展下一個(gè)細(xì)胞株之操作。臨時(shí)放置，其它試驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。試驗(yàn)用品以70%ethanol擦之容器正上方操作試驗(yàn)。容器翻開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。CO2鋼瓶之CO2壓力、CO2培育箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)、無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。水槽可添加飽和硫酸銅溶液，并定期換水。6、血清的相關(guān)問題：血清必需貯存于–20℃，假設(shè)存放于4℃，不要超過一個(gè)月。假設(shè)一次無法用完一瓶，可將40～45ml50ml離心管中，預(yù)留此膨脹體積之空間，以免容器凍裂。培育基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。瓶裝(500ml)血清肯定要逐步解凍:4中須規(guī)章?lián)u擺均勻(留神勿造成氣泡)–20℃37℃解凍，因溫度轉(zhuǎn)變太大，簡潔造成蛋白質(zhì)分散而發(fā)生沉淀。56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)章?lián)u擺均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必需，一般不要作此熱處理，由于會(huì)造成沉淀要好些。細(xì)胞培育基的根本學(xué)問.doc(36.5k)good,很有幫助，感謝7、貼壁細(xì)胞傳代培育：一般步驟為：真空泵吸走培育基，1XPBS漂洗兩次，參加1mlEDTA-Tripsin〔100mm皿為例37數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，離心后參加穎培育基，按比例轉(zhuǎn)移至皿。觀看立體感不強(qiáng)，嚴(yán)峻的時(shí)候甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。我談?wù)剛€(gè)人閱歷：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時(shí)間可適當(dāng)放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較簡潔脫落，2min足矣，P19Cl6293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換穎培育基打散。8、細(xì)胞凍存及復(fù)蘇：首先說凍存液配方，常用的配方一般是兩種 ——90%FCS+10%DMSO或70%培育基+20%FCS+10%DMSO。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯(cuò)，因此本人一般選用第二種配方。對于比較脆弱的細(xì)胞則選用前一種凍存液。底部，參加適量凍存液使細(xì)胞完全懸浮后分裝于凍存管。制后先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。接著置于-20℃冰箱，約60min。置于-80超低溫冰箱中放置過夜。最終置于液氮罐中長期保存。同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。留意事項(xiàng)：1>使用DMSO前，不需要進(jìn)展高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞它的分子構(gòu)造，以至于降低冷凍保護(hù)效果。2>凍存時(shí)要選處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，這樣效果要好很多3>不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危急溫區(qū)”。4>留意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，準(zhǔn)時(shí)添加。5>凍存液中種類。6>凍存液不要預(yù)熱。7>程序凍存盒格外好用，省事省時(shí)效果還好，猛烈推舉凍存使用凍存盒。細(xì)胞復(fù)蘇的原則是快速溶化：必需將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速溶化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶快速溶化，避開冰晶緩慢溶化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。具體步驟：將水浴鍋預(yù)熱至40℃7530min的超凈工作臺臺面。在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培育瓶等等。依據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。溶化。1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，3000r/min3min吸棄上清液。向凍存管內(nèi)參加1ml培育液，吹打制成細(xì)胞懸液。最終將細(xì)胞懸液分裝入培育瓶內(nèi)，將培育瓶放入375％CO212-24小時(shí)后換液連續(xù)培育培育，換液的時(shí)間由細(xì)胞狀況而定。留意事項(xiàng)：1>復(fù)蘇時(shí)選用的培育基要符合凍存管上標(biāo)明的培育基。2>操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之損害。3>自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由,寫錯(cuò)了~好東西，感謝你的辛勤勞動(dòng)。真空泵中間接一個(gè)10000ml的大燒瓶啊~可以了那要看你用什么真空泵了.我們試驗(yàn)室用的水泵,不會(huì)大量產(chǎn)熱,即使是空轉(zhuǎn)也沒有關(guān)系.單純用電機(jī)抽真空確定是不行的.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕具體操作：一.傳代前預(yù)備：預(yù)熱培育用液：把已經(jīng)配制好的裝有培育液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照耀的超凈工作臺和雙手。正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可削減污染。點(diǎn)燃酒精燈：留意火焰不能太小。預(yù)備好將要使用的消毒后的空培育瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。臺內(nèi)。從培育箱內(nèi)取出細(xì)胞：留意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀看細(xì)胞。翻開瓶口：將各瓶口一一翻開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。二.胰蛋白酶消化；參加消化液：留神吸出舊培育液，用PBS清洗〔沖洗，參加適量消化液〔胰蛋白酶液留意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最正確消化溫度是37℃。顯微鏡下觀看細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀看消化細(xì)胞，假設(shè)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，說明此時(shí)細(xì)胞消化適度。吸棄消化液參加培育液：棄去胰蛋白酶液，留意更換吸管，參加穎的培育液。三.吹打分散細(xì)胞：吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。棄上清液，參加培育液：棄去上清液，參加2ml培育液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。四.分裝稀釋細(xì)胞：分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培育瓶中，參加適量培育基旋緊瓶蓋。顯微鏡下觀看細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀看細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。留意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)當(dāng)不低于5×105/ml。最終要做好標(biāo)記。今日做亞細(xì)胞定位，間。這樣一來就會(huì)影響到觀看和拍照。液加進(jìn)去，這就避開了以上現(xiàn)象。養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)備工作消耗了我好長時(shí)間。1、查資料總結(jié)需要的儀器設(shè)備〔要找到型號、價(jià)格、購置途徑、試劑〔廠商、型號、規(guī)格、價(jià)格、購置途徑、雜碎用品〔價(jià)格、購置途徑〕2、聯(lián)系廠商購貨，大型儀器還要填報(bào)建設(shè)工程申請表，等待學(xué)校招標(biāo)。3、著手建立試驗(yàn)室。缺少的東西還要和其他院系溝通，爭取合作。4、因本人是試驗(yàn)室第一個(gè)做細(xì)胞的，還要找到其他教師，幫他們做試驗(yàn)，同時(shí)學(xué)細(xì)胞培育的學(xué)問。MTT又是個(gè)細(xì)節(jié)問題極多的操作，做起來是需要一段時(shí)間摸索的。,最好的方法就是借一本好的細(xì)胞培育書:薛慶善<<體外培育的原理和技術(shù)>>和司徒鎮(zhèn)強(qiáng)編的<<細(xì)胞培育>>都很好.只有書上說的才是最具體的,很多東西可以知其然,并且知其所以然.固然,從其他人那里可以得到一些學(xué)問,但是為什么如此,不如此會(huì)有什么結(jié)果,比方:刷瓶子有什么用?泡酸有什么用?很多人只能夠籠統(tǒng)的說滅菌,其實(shí)不盡然.固然,我的意思并不是說,知道這些很重要,而是強(qiáng)調(diào),從書上我們能夠獲得最詳盡最直接的知識.當(dāng)書上說得不具體時(shí),則可以來這里問問各位戰(zhàn)友,有的放矢,方為上策感謝上面的幾位朋友的大力幫助,我也再次溫習(xí)了一次很有幫助.感謝格外不錯(cuò),讓我這個(gè)初學(xué)者受益匪淺!!,受益匪淺我是個(gè)手，現(xiàn)在正預(yù)備做試驗(yàn)。這些東西對我格外有用，感謝大家,馬上就開頭做試驗(yàn),大家都寫的很多了，再補(bǔ)充一些關(guān)于試劑購置：肯定要按ATCC或者細(xì)胞系構(gòu)建者的建議使用相應(yīng)的培育基，我試過用不同的，感覺培育FBS最好能用進(jìn)口的，hyclone或者gibco的都很好用。培育基使用一段時(shí)間后要留意酸堿度，我的閱歷用過一段時(shí)間后很簡潔偏堿，對細(xì)胞的生長還是有一些影響的。CuSO4可以抑制霉菌的生長，我們始終在用，效果不錯(cuò)。另外有個(gè)問題想問一下，大家擦培育箱的時(shí)候用什么擦？我們以前始終用復(fù)合醛再用酒精，可是最近看一個(gè)試驗(yàn)室根本不怎么擦位前輩的總結(jié)，獲益匪淺！培育箱每周一次0.1%潔爾滅或75%酒精擦洗,但是我們試驗(yàn)室之前也很少這么做也不見有問題!我覺得還是擦洗一下別抱幸運(yùn)心理好.太好了，多謝啊不錯(cuò)不錯(cuò)感謝啊看了收益非淺，我要開頭做后，也會(huì)把心得記錄下來，和戰(zhàn)友們進(jìn)展溝通。不過，目前我還是手，期望大多指導(dǎo)哦！關(guān)注之---受益匪淺啊感謝啦~~沒想到今日進(jìn)這個(gè)板塊受益這么多多謝諸位請教各位教師了 :我這兩天配培育液,是GIBC0的DMEM/F12,依據(jù)以往的閱歷,將一袋DMEM/F12溶于1000毫升水,約參加2至3克NAHCO3,調(diào)PH值7.28左右就可以了,可是我這次只加了0.3克,PH值就7.28了,我很驚詫,只好過濾了,結(jié)果其次天覺察不管放在溫箱里的三管培育液還是放在-20℃冰箱里的培育液全變黃了.真是怪事,請大家分析以下怎么回事