實驗一外周血淋巴細胞的分離課件

實驗一

外周血淋巴細胞的分離

實驗一

外周血淋巴細胞的分離

1PBMC:peripherialbloodmononuclearcell(Tcell,Bcellandmonocyte)PBMC:peripherialbloodmononu2原理外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。

原理外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分層液（F3原理外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

(PBMC)1.092原理外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.41500rpm,20℃,30minPBMC紅細胞粒細胞Ficoll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、血小板1500rpm,20℃,30minPBMC紅細胞粒細胞5實驗步驟1.采血，稀釋（外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）實驗步驟1.采血，稀釋6實驗步驟3.18℃，1500r/min，離心30min4.

輕輕吸取PBMC層移入另一試管中5.加足量稀釋液充分洗滌，1800r/min離心5min，棄上清。實驗步驟3.18℃，1500r/min，離心30min7注意事項每毫升外周血液大約可獲1×106單個核細胞Ficoll應適量，外周血應充分稀釋溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果在Ficoll上加入稀釋外周血時，應緩慢加，以免沖散界面吸取單個核細胞層時，應避免吸出過多的上清液或分層液而導致血小板污染注意事項每毫升外周血液大約可獲1×106單個核細胞8細胞計數(shù)1、準備計數(shù)板：2、制備細胞懸液：收集細胞，制成單個細胞懸液3、加樣：用吸管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液，在計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細胞懸液，4、計數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)

細胞計數(shù)1、準備計數(shù)板：9實驗一外周血淋巴細胞的分離課件10實驗步驟5、計算：細胞數(shù)/毫升=（4大格細胞數(shù)之和/4）×104實驗步驟5、計算：11

注意事項1.取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液2.加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡3.細胞壓中線時，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右4.本法要求細胞密度不低于104細胞/ml5.鏡下計數(shù)時，細胞數(shù)過少或過多，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液、計數(shù)

注意事項1.取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液12Enzyme-linkedimmunoabsobantassays(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-linkedimmunoabsobanta13原理:antigen+antibody必需條件:specificityvisibility

Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)原理:Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)14目的原理

本法是指用酶標記抗體進行抗原抗體反應，從而將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷實驗結(jié)果，可經(jīng)酶標測定儀作定量分析，靈敏度可達微微克（pg）水平。常用于標記的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP），它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性，這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標抗體可保存較長時間。目的原理

本法是指用酶標記抗體進行抗原抗體反應，從而將抗原抗15酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA），簡稱酶標法，是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種技術(shù)?；镜姆椒ㄓ腥?，即間接法、雙抗夾心法和抗原競爭法。Enzyme-linkedimmunoabsobantassays酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzymelinkedimmun16實驗一外周血淋巴細胞的分離課件17雙抗夾心法1stAbsubstratesColoredproductsEnzyme2ndAbAg1stAbcaptureantibodylabeled/detectiveAb雙抗夾心法1stAbsubstratesColoredp18實驗步驟1.

包被：取羊抗鼠IgG包被單抗20ug,用0.01MTris-HCl稀釋至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4℃過夜；2.

封閉：用洗滌液(含0.01%Tween-20的0.01MPBS)洗滌兩次,然后加入封閉液(含15%小牛血清的0.01MPBS),每孔300ul,37℃,孵育2h；3.加樣品：洗滌兩次,加入標準品鼠IgG1ug/ml,每孔100ul,37℃,孵育2h；4.加羊抗鼠IgG-Fc-HRP:洗滌兩次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37℃孵育1h；實驗步驟1.

包被：取羊抗鼠IgG包被單抗20ug,用0.0195.加底物顯色：洗滌兩次，加底物OPD反應液每孔100ul，置于室溫5－10min；6.終止：加終止液2MH2SO450ul每孔；7.檢測及繪制標準曲線：于490nm處檢測OD值，標準曲線的斜率：b＝ΣXY/ΣX2,標準曲線Y＝b·X(其中，X：濃度（標準品）；Y：比色OD值的均值)。８.繪制標準曲線后，通過各孔的OD值在標準曲線上相應位置計算出相應濃度實驗一外周血淋巴細胞的分離課件20實驗目的1、熟悉酶聯(lián)免疫檢測手段的原理。2、掌握雙抗夾心ELISA的試驗操作。實驗目的1、熟悉酶聯(lián)免疫檢測手段的原理。21

B淋巴細胞雜交實驗四B淋巴細胞雜交實驗四22

雜交瘤的目的

---制備單克隆抗體

23雜交瘤技術(shù)的基本原理具有分泌抗體功能的B細胞難以在體外長期存活。利用細胞融合技術(shù)，將免疫后的B細胞與在體外能長期存活的骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)過選擇培養(yǎng)獲取雜交細胞，這種細胞稱為雜交瘤細胞.（Hybridoma）該細胞的特點：

雜交瘤技術(shù)的基本原理24實驗一外周血淋巴細胞的分離課件25

選擇動物Themouseisusuallytheanimalofchoice.Suitablemousemyelomacelllinesarewidelyavailable,andgrownofhybridomasinmiceisusuallynoproblem.Allofthecurrentlyavailablemousemyelomalines,whicharesuitableforfusion,areofBALB/Corigin,6-8week,femalemouseisusuallyused.選擇動物261wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，加入等量福氏完全佐劑（CFA）充分乳化，分頸、部皮下多點及腹腔注射；3wk抗原的劑量及注射的部位同上，僅將全佐改為半佐（IFA）；5wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，腹腔注射；加強融合前3~5天，抗原20~30μg/只，溶于50μl生理鹽水中小鼠尾靜脈注射以加強免疫（抗原沖擊）動物免疫一、可溶性抗原動物免疫一、可溶性抗原271wk細胞數(shù)量8×106/只，洗滌三遍，用0.3~0.4ml的生理鹽水重懸，腹腔注射；3wk細胞數(shù)量6×106/只，細胞的預處理及注射的部位同上；5wk細胞數(shù)量5×106/只，細胞的預處理及注射的部位同上；加強融合前的4~5天，細胞數(shù)量3×106/只，加強免疫

在以腫瘤細胞作免疫原時，為避免免疫過程中小鼠因生長腫瘤而死亡，故用絲裂霉素（MMC）處理免疫原細胞，抑制其生長繁殖以防形成腫瘤。最后的加強免疫，腫瘤細胞可不經(jīng)MMC處理。

二、細胞抗原動物免疫1wk細胞數(shù)量8×106/只，洗滌三遍，用0.328PEG：親水性，使細胞表面極性降低，導致脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，引起細胞融合。分子量：1500-2000

融合劑PEG：融合劑29

HAT:次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶（thymidine,T）細胞的DNA生物合成有兩條途徑：HAT選擇性培養(yǎng)TKH、THGPRT細胞的DNA生物合成有兩條途徑：HAT選擇性培養(yǎng)TK30脾細胞與骨髓瘤細胞融合后的細胞類型未發(fā)生融合骨髓瘤細胞及其同核融合體：其DNA合成的主要途徑被A阻斷后，由于缺乏HGPRT而不能利用培養(yǎng)液中的H，雖TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成過程；未發(fā)生融合的脾細胞及其同核融合體：培養(yǎng)液中不能長期生長，7天左右即死亡脾細胞和骨髓瘤細胞的異核融合體：即雜交瘤細胞，既從脾細胞獲得了HGPRT和TK，從而利用培養(yǎng)液中的H和T合成DNA，又從骨髓瘤細胞獲得了無限增殖的能力，因此能在HAT選擇培養(yǎng)液中生存下來。脾細胞與骨髓瘤細胞融合后的細胞類型未發(fā)生融合骨髓瘤細胞及其同31處死小鼠，固定于解剖架上打開腹腔，取出脾臟。置于120目的鋼絲網(wǎng)中，將網(wǎng)移入盛有20ml生理鹽水的平皿中，用注射針芯輕輕壓磨，使其成為單個細胞懸液，吸取1ml細胞懸液（約5×106細胞）,與骨髓瘤細胞SP2/0（5×105細胞）混合，離心后棄上清骨髓瘤細胞:脾細胞為1:10一個脾臟可獲約108個細胞實驗步驟：免疫脾細胞的制備處死小鼠，固定于解剖架上打開腹腔，取出脾臟。置于120目的鋼32

1、取PEG溶液1.0ml緩慢加入混合細胞中,邊加邊攪拌；2、靜止1分鐘；3、加HAT培養(yǎng)基4ml；4、取融合細胞懸液1ml,滴加在96孔培養(yǎng)板中，每孔1滴（約50μl）；5、顯微鏡下觀察融合細胞的狀態(tài)實驗步驟：細胞的融合1、取PEG溶液1.0ml緩慢加入混合細胞中,邊33實驗目的：

1、了解細胞雜交及單抗制備的基本原理；2、掌握細胞融合的基本操作。※

實驗結(jié)束后，將實驗小鼠放入垃圾袋，使用過的剪刀、鑷子、試管及培養(yǎng)板等沖洗干凈，放回原處，謝謝合作！

實驗目的：※實驗結(jié)束后，將實驗小鼠放入垃圾袋，使用過的34免疫學實驗2-----免疫熒光技術(shù)

免疫學實驗2-----免疫熒光技術(shù)35原理:antigen+antibody必需條件:specificityvisibility

Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)原理:Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)36一、原理免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）-------將抗體（或抗原）經(jīng)熒光素標記，然后再與相應的抗原（或抗體）結(jié)合，在一定波長光波的照射下，被標記的熒光素放出可見光（稱為熒光），借助熒光顯微鏡或流式細胞儀可對待測抗體或抗原進行定性和定量分析。一、原理37

目前用于免疫熒光分析的熒光素異硫氫酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)；藻紅蛋白（R-PE）由于這些熒光素經(jīng)激發(fā)光照射后可發(fā)射出不同波長的熒光，因而可對細胞的一種或多種蛋白進行示蹤。免疫熒光技術(shù)主要用于分析的標本有：外周血新鮮細胞、培養(yǎng)細胞、組織切片等目前用于免疫熒光分析的熒光素異硫氫酸熒光素（fluores38

二、

用于抗原分析的免疫熒光法

1、直接法----將熒光素