殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法免疫分析法課件

②抗原性（antigenicity)，指與抗體反應(yīng)的性質(zhì)，這種結(jié)合反應(yīng)具有特異性。抗原的這兩種特性是不同的，具有免疫原性的物質(zhì)必然有抗原性，反之則不一定成立。具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，只具有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原，它能與抗體結(jié)合但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.②抗原性（antigenicity)，指與抗體反應(yīng)的12.抗體（antibody,Ab)機(jī)體受抗原刺激后，在體液中出現(xiàn)一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，因其具有免疫活性，習(xí)慣上稱為免疫球蛋白.

2.抗體（antibody,Ab)24.抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過大量非共價(jià)鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等?？乖涂贵w在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。4.抗原抗體反應(yīng)35.免疫分析免疫分析方法是研究免疫學(xué)的工具。免疫分析是基于抗原抗體之間的特異性相互作用從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原、抗體或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析檢測(cè)的方法。免疫反應(yīng)的高選擇性、高親和性和高靈敏性為免疫分析的可靠和準(zhǔn)確提供了保證。5.免疫分析4從本質(zhì)上講，幾乎所有的免疫分析都是基于識(shí)別位點(diǎn)的占據(jù)率的測(cè)定，根據(jù)這種反應(yīng)性質(zhì)可分為競(jìng)爭(zhēng)免疫分析和非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析。從本質(zhì)上講，幾乎所有的免疫分析都是基于識(shí)別位點(diǎn)的占據(jù)率的測(cè)定5二、酶聯(lián)免疫吸附分析法1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。

ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。二、酶聯(lián)免疫吸附分析法1971年瑞典學(xué)者Engvail和Pe6酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性和強(qiáng)特異性于一體，表現(xiàn)出簡(jiǎn)單、快速、靈敏和選擇性高等優(yōu)勢(shì)，在20世紀(jì)80年代得到了快速發(fā)展，尤其在農(nóng)藥殘留測(cè)定方面表現(xiàn)最為活躍。采用EIJSA法不僅可以定性，而且可以定量，使用多孔滴定板，一次可進(jìn)行大批量樣品的測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性7用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性和強(qiáng)特異性于一體，表現(xiàn)出簡(jiǎn)單、快速、靈敏和選擇性高等優(yōu)勢(shì)，在20世紀(jì)80年代得到了快速發(fā)展，尤其在農(nóng)藥殘留測(cè)定方面表現(xiàn)最為活躍。4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽ELISA方法的建立包括待測(cè)農(nóng)藥、滴定板和酶的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法及質(zhì)量控制等。4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)三、ELISA應(yīng)用實(shí)例ELISA方法的建立包括待測(cè)農(nóng)藥、滴定板和酶的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法及質(zhì)量控制等。用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；抗原與抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過大量非共價(jià)鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等。甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、③酶作用的底物（顯色劑）抗原和抗體在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的EIASA試劑盒種類很多，不僅能用于各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測(cè)多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素。已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的EIASA試劑盒種類很多，不僅能用于各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測(cè)多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素。ELISA一次只能檢測(cè)單一農(nóng)藥或結(jié)構(gòu)近似的少數(shù)幾種農(nóng)藥，不能解決農(nóng)藥多殘留分析問題。而且抗體制備難度較大。用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；已商品化的篩8目前抗體數(shù)量還較少；分析會(huì)受到特異性或非特異性的干擾；如果在不能肯定試樣中農(nóng)藥品種的情況下，檢測(cè)具有一定的盲目性；此外有可能出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象等等。隨著技術(shù)的日趨成熟，ELISA在農(nóng)藥殘留速測(cè)中的應(yīng)用會(huì)得到新的發(fā)展。目前抗體數(shù)量還較少；分析會(huì)受到特異性或非特異性的干擾；如果在91.基本原理將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性．使抗原或抗體與某種酶連接．這種酶標(biāo)抗原或抗體同時(shí)其有免疫活性和酶的活性；待測(cè)樣品和酶標(biāo)抗原或抗體與包被的抗原或抗體經(jīng)過一系列反應(yīng)；用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；加入酶反應(yīng)的底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成有色產(chǎn)物，一定條件下，產(chǎn)物的色澤與待測(cè)物的含量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。1.基本原理10底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234底物顯色原理包被反應(yīng)洗滌123411在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：12

測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活13其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。14

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)15酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶底物顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲16殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法免疫分析法課件17三、ELISA應(yīng)用實(shí)例測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。西維因（Carbaryl）、已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的EIASA試劑盒種類很多，不僅能用于各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測(cè)多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素。1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。②抗原性（antigenicity)，指與抗體反應(yīng)的性質(zhì)，這種結(jié)合反應(yīng)具有特異性。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)已商品化的篩選農(nóng)藥殘留的EIASA試劑盒種類很多，不僅能用于各種食品和多種環(huán)境樣品中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分析，而且也能檢測(cè)多種環(huán)境污染物，如多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴，以及黃曲霉素等多種天然毒素?？乖c抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過大量非共價(jià)鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等。飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原?？乖涂贵w在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)三、ELISA應(yīng)用實(shí)例18殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法免疫分析法課件19具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，只具有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原，它能與抗體結(jié)合但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、加入酶反應(yīng)的底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成有色產(chǎn)物，一定條件下，產(chǎn)物的色澤與待測(cè)物的含量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)④陰性和陽性對(duì)照品（定性測(cè)定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）；酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）集抗原抗體反應(yīng)的高靈敏性和強(qiáng)特異性于一體，表現(xiàn)出簡(jiǎn)單、快速、靈敏和選擇性高等優(yōu)勢(shì)，在20世紀(jì)80年代得到了快速發(fā)展，尤其在農(nóng)藥殘留測(cè)定方面表現(xiàn)最為活躍。ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定分析會(huì)受到特異性或非特異性的干擾；ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)3.ELISA方法的建立

ELISA方法的建立包括待測(cè)農(nóng)藥、滴定板和酶的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法及質(zhì)量控制等。具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，只具有抗原性的物質(zhì)稱為半20殘留農(nóng)藥檢測(cè)方法免疫分析法課件21三、ELISA應(yīng)用實(shí)例

飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用三、ELISA應(yīng)用實(shí)例飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定ELISA22

甲胺磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)甲胺磷殘留分析ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)23

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測(cè)：主要有除草劑與殺蟲劑兩大類農(nóng)藥的檢測(cè)：24三、ELISA應(yīng)用實(shí)例甲基對(duì)硫磷殘留分析抗原和抗體在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。⑤結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；免疫分析是基于抗原抗體之間的特異性相互作用從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原、抗體或相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析檢測(cè)的方法。測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原，只具有抗原性的物質(zhì)稱為半抗原，它能與抗體結(jié)合但不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.如果在不能肯定試樣中農(nóng)藥品種的情況下，檢測(cè)具有一定的盲目性；飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭磺胺二甲嘧啶及磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè)試劑盒；飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定加入酶反應(yīng)的底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成有色產(chǎn)物，一定條件下，產(chǎn)物的色澤與待測(cè)物的含量直接相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量分析。ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)快速ELISA試劑盒ELISA試劑盒目前在食品檢測(cè)、水產(chǎn)品檢測(cè)、動(dòng)物檢疫檢測(cè)和農(nóng)藥殘留檢測(cè)等方面已得到了廣泛的應(yīng)用。它具有快速、靈敏度高、測(cè)定步驟簡(jiǎn)便、成本低、操作安全等特點(diǎn)，完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：①包被抗原或抗體的固相載體；②酶標(biāo)抗原或抗體；③酶的底物；④陰性和陽性對(duì)照品（定性測(cè)定），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）；⑤結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；⑥洗滌液；⑦酶反應(yīng)終止液。三、ELISA應(yīng)用實(shí)例快速ELISA試劑盒ELISA試劑盒25商品化產(chǎn)品：非典型肺炎冠狀病毒抗體酶聯(lián)免疫試劑盒克倫特羅檢測(cè)試劑盒；磺胺二甲嘧啶及磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè)試劑盒；氯霉素檢測(cè)試劑盒；商品化產(chǎn)品：26酶免疫分析儀器酶免疫分析儀器27抗原和抗體在體內(nèi)進(jìn)行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。用洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離；測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽非典型肺炎冠狀病毒抗體酶聯(lián)免疫試劑盒克倫特羅檢測(cè)試劑盒；這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。例如殺暝松（FN）、ELISA方法的建立它具有快速、靈敏度高、測(cè)定步驟簡(jiǎn)便、成本低、操作安全等特點(diǎn)，完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：①包被抗原或抗體的固相載體；1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。主要有除草劑與殺蟲劑兩大類將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性．使抗原或抗體與某種酶連接．這種酶標(biāo)抗原或抗體同時(shí)其有免疫活性和酶的活性；飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，簡(jiǎn)曲霉毒素）4.抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體相互作用是免疫學(xué)的基礎(chǔ)，二者通過大量非共價(jià)鍵連接，包括靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力等。