藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則

藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述遺傳毒性研究（GenotoxicityStudy）是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，它與其他毒理學研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進入臨床試驗及上市的重要環(huán)節(jié)。擬用于人體的藥物，應(yīng)根據(jù)受試物擬用適應(yīng)癥和作用特點等因素考慮進行遺傳毒性試驗。遺傳毒性試驗是指用于檢測通過不同機制直接或間接誘導(dǎo)遺傳學損傷的受試物的體外和體內(nèi)試驗，這些試驗?zāi)軝z出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目改變形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，一般被認為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，并且是惡性腫瘤發(fā)展過程的環(huán)節(jié)之一（這種遺傳學改變僅在復(fù)雜的惡性腫瘤發(fā)展變化過程中起了部分作用）。在檢測此類損傷的試驗中呈陽性的化合物為潛在致癌劑和/或致突變劑，即可能誘導(dǎo)癌和/或遺傳性疾病。由于在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關(guān)系，而對于遺傳性疾病尚難以證明有類似的關(guān)系，故遺傳毒性試驗主要用于致癌性預(yù)測。但是，因為已經(jīng)確定生殖細胞突變與人類疾病有關(guān)，所以對可能引起可遺傳效應(yīng)的化合物與可能引起癌癥的化合物應(yīng)引起同樣的關(guān)注；此外，這些試驗的結(jié)果可能還有助于解釋致癌性的機制和試驗結(jié)果。因此，在藥物開發(fā)的過程中，遺傳毒性試驗的目的是通過一系列試驗來預(yù)測受試物是否有遺傳毒性，在降低臨床試驗受試者和藥品上市后使用人群的用藥風險方面發(fā)揮重要作用。本指導(dǎo)原則重點闡述遺傳毒性試驗體內(nèi)外試驗的基本原則，并介紹標準試驗組合方案，以及對試驗結(jié)果的綜合分析及評價。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學藥物的遺傳毒性試驗研究。二、基本原則（一）實驗管理藥物的遺傳毒性試驗屬于安全性評價研究，根據(jù)《中華人民共和國藥品管理法》的規(guī)定，必須執(zhí)行《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》。（二）具體問題具體分析遺傳毒性試驗的設(shè)計，應(yīng)該在對受試物認知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)特點、理化性質(zhì)、已有的藥理毒理研究信息、適應(yīng)癥和適用人群特點、臨床用藥方案選擇合理的試驗方法，設(shè)計適宜的試驗方案，并綜合上述信息對試驗結(jié)果進行全面的分析評價。（三）隨機、對照、重復(fù)遺傳毒性試驗應(yīng)符合毒理學試驗的基本原則，即隨機、對照和重復(fù)的原則。三、基本內(nèi)容（一）受試物1、中藥、天然藥物受試物應(yīng)能充分代表臨床研究受試物或上市藥品，因此受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床研究質(zhì)量標準規(guī)定的樣品，一般用中試樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等。如不采用中試樣品，應(yīng)有充分的理由。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標明批號、規(guī)格及生產(chǎn)廠家。2、化學藥物受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床研究用質(zhì)量標準規(guī)定的樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應(yīng)標明批號、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，并符合試驗要求。（二）試驗設(shè)計的總體考慮對藥物而言，需對潛在的遺傳毒性進行全面評價，遺傳毒性試驗可用作鑒定體細胞誘變劑、生殖細胞誘變劑和潛在的致癌物。目前，遺傳毒性試驗方法較多，所使用的生物材料多種多樣，可以利用原核細胞到真核細胞直至高等哺乳動物細胞在體外進行添加或不添加代謝活化物質(zhì)的試驗，也可在整體動物上進行體內(nèi)試驗；根據(jù)試驗檢測的遺傳終點可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷與修復(fù)；從試驗系統(tǒng)來分，遺傳毒性試驗可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。因體內(nèi)和體外試驗差異較大，以下分別討論體外試驗和體內(nèi)試驗的基本要求。由于體內(nèi)外的試驗方法均較多，本指導(dǎo)原則僅討論常用方法及需要重點關(guān)注的問題，具體試驗時需根據(jù)具體情況具體分析。1、體外試驗基本要求1．1細菌回復(fù)突變試驗中采用的基本菌株在細菌回復(fù)突變試驗中至少應(yīng)采用5種菌株，包括用于檢測組氨酸靶基因中鳥嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點堿基置換或移碼突變的4種組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA1535；TA1537/TA97/TA97a（注釋1）；TA98；TA100），以及用于檢測組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點堿基置換或移碼突變的鼠傷寒沙門氏菌TA102或埃希氏大腸桿菌WP2

uvrA或埃希氏大腸桿菌WP2

uvrA

（pKM101）（注釋2）。由于檢測G-C位點突變的4種菌株無法檢測交聯(lián)劑，因此檢測交聯(lián)劑時最好采用TA102菌株或增加一種修復(fù)準確型大腸桿菌（如埃希氏大腸桿菌WP2

uvrA

（pKM101））。1．2體外試驗中最高濃度的確定（注釋3）體外試驗中受試物的最高濃度主要取決于受試物對細菌/細胞的毒性和溶解度。1．2．1無毒化合物的高濃度對易溶解的無毒化合物，細菌試驗應(yīng)達到的最高濃度為5mg/皿，哺乳動物細胞試驗為5mg/ml或10mM（選用較低者）。1．2．2要求達到的細胞毒性水平在遺傳毒性體外試驗中，某些遺傳毒性致癌劑只有在檢測濃度高達可產(chǎn)生一定程度的細胞毒性時才可檢出，但毒性過高又可影響對相應(yīng)的遺傳終點進行恰當?shù)脑u價。當哺乳類動物細胞存活率很低時，一些遺傳毒性以外的作用機制如細胞毒性（如與細胞凋亡、溶酶體釋放核酸內(nèi)切酶等有關(guān)的結(jié)果）會導(dǎo)致遺傳毒性的假陽性結(jié)果，這種情況常發(fā)生于受試物濃度達到毒性閾濃度時。鑒于以上情況，在體外細菌和哺乳類動物細胞試驗中，目前可接受以下的細胞毒性水平（濃度不應(yīng)超過1.2.1中的規(guī)定）：（1）在細菌回復(fù)突變試驗中，最高濃度應(yīng)能顯示明顯的毒性，如回復(fù)突變數(shù)減少、背景菌斑減少或消失。（2）哺乳動物細胞體外遺傳毒性試驗中，毒性水平應(yīng)高于50%細胞抑制率或細胞融合率，對培養(yǎng)的淋巴細胞，有絲分裂指數(shù)抑制率應(yīng)高于50%。（3）哺乳動物細胞體外基因突變試驗中，理想的最高濃度應(yīng)能產(chǎn)生至少80%毒性（即存活率不大于20%）?？赏ㄟ^評價平板接種效率或相對總生長率測定毒性。對于細胞存活率低于10%時獲得的陽性結(jié)果，應(yīng)謹慎對待。1．2．3難溶受試物的檢測在用細菌和哺乳動物細胞遺傳毒性試驗檢測某些受試物時，在不溶解的濃度范圍內(nèi)也能檢測出劑量相關(guān)性的遺傳毒性（注釋4）。建議采用以下策略檢測相對不溶的受試物，該建議僅針對培養(yǎng)基中的受試物。（1）若未觀察到細胞毒性，應(yīng)以產(chǎn)生沉淀的最低濃度作為最高濃度，但細菌試驗不超過5mg/皿，哺乳動物細胞不超過5mg/ml或10mM。（2）若觀察到劑量相關(guān)性的細胞毒性或誘變性，則不管溶解度如何，應(yīng)按上述1.2.2要求的毒性水平來確定最高濃度，這需要檢測多個產(chǎn)生沉淀的濃度。但當沉淀量影響到結(jié)果觀察時，則無法達到所要求的細胞毒性的劑量水平。在給藥處理開始前和結(jié)束時，均應(yīng)用肉眼評價沉淀量。1．3體外試驗的重現(xiàn)性體外試驗應(yīng)關(guān)注重現(xiàn)性。體外試驗通常應(yīng)進行重復(fù)試驗。但是，當采用標準的、已廣泛應(yīng)用的常規(guī)體外試驗方法時，若這些試驗經(jīng)過了充分驗證且進行了有效的內(nèi)部質(zhì)量控制，可不必進行重復(fù)試驗，例如：對哺乳動物細胞基因突變試驗，進行了規(guī)范的范圍確定試驗，其可提供足夠的數(shù)據(jù)以保證試驗方法的正確性；對體外染色體損傷的細胞遺傳學試驗和小鼠淋巴瘤tk試驗，采用了合適的、規(guī)范的方法，如包括有陽性和陰性對照、加和不加代謝活化的試驗、處理時間及采樣時間合適等。在進行這些試驗后，若得到明確的陽性或陰性結(jié)果，一般可不需要進行其他確證性試驗；但若得到可疑結(jié)果，則需要進一步試驗。2、體內(nèi)試驗基本要求2．1體內(nèi)試驗的給藥途徑一般情況下，給藥途徑應(yīng)與臨床擬用途徑一致。若不一致，應(yīng)說明理由。2．2體內(nèi)檢測染色體斷裂劑的骨髓試驗嚙齒類動物骨髓有核細胞的染色體畸變試驗可以檢測多種染色體完整性方面的改變，該類變化幾乎均來源于原發(fā)性的單個或多個染色單體斷裂。如果產(chǎn)生了一個無著絲點片段，染色單體或染色體斷裂就導(dǎo)致微核形成，因而檢測染色體畸變或微核的方法可用于檢測斷裂劑（注釋5）。由于細胞分裂后期的一個或多個染色體相對滯后也能形成微核，因而微核檢測方法也能檢測一些非整倍體誘導(dǎo)劑（注釋6）。總之，體內(nèi)骨髓細胞染色體畸變試驗或骨髓嗜多染紅細胞微核試驗均可用于檢測斷裂劑。此外也可以通過測定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）紅細胞的微核率來檢測斷裂劑，除小鼠外，也可采用其他脾臟無法清除帶微核的紅細胞或?qū)嗔褎┗蚍钦扼w誘導(dǎo)劑有足夠靈敏度的動物。2．3骨髓微核試驗中嚙齒類動物性別的選用對小鼠微核試驗檢測已知斷裂劑的許多研究表明，通常雄性小鼠比雌性小鼠對誘導(dǎo)微核更敏感，二者之間僅有量的差異而無質(zhì)的差異，但若性別間存在顯著的量的差別則會導(dǎo)致性別間的毒性不同。若性別間代謝產(chǎn)物有明顯的質(zhì)的差別，則應(yīng)采用二種性別的動物。類似的原則同樣適用于其他體內(nèi)試驗方法（注釋7）。骨髓微核試驗可采用小鼠或大鼠。總之，在微核試驗中，除非性別間在毒性或代謝方面有明顯差異，一般單用雄性動物即可。如果受試物專用于一種性別，則通常選用相應(yīng)性別的動物進行試驗。（三）標準試驗組合遺傳毒性試驗方法有多種，但沒有任何單一試驗方法能檢測出所有的遺傳毒性物質(zhì)，因此，通常采用體外和體內(nèi)遺傳毒性試驗組合的方法，以減少遺傳毒性物質(zhì)的假陰性結(jié)果。這些試驗相互補充，對結(jié)果的判斷應(yīng)綜合考慮。1、標準試驗組合應(yīng)具備的特征標準試驗組合應(yīng)反映不同遺傳終點，包括體內(nèi)和體外試驗，從原核到真核細胞，因此應(yīng)包含以下內(nèi)容：（1）應(yīng)包含細菌回復(fù)突變試驗，因為該試驗已被證明能檢出相關(guān)的遺傳學改變和大部分嚙齒類動物遺傳毒性致癌劑。（2）因細菌不能完全檢測DNA損傷，應(yīng)采用哺乳動物細胞進行評價。目前正在使用的幾種哺乳動物細胞系有：檢測染色體損傷的細胞系（染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目畸變的體外試驗）；主要檢測基因突變的細胞系（注釋8）；檢測基因突變與染色體斷裂作用的細胞系（小鼠淋巴瘤tk試驗）（注釋9）?，F(xiàn)有研究表明，對于檢測具有遺傳毒性但在細菌回復(fù)突變試驗中結(jié)果為陰性的化合物，在采用合適的試驗方案條件下，檢測染色體損傷的各種體外試驗與小鼠淋巴瘤tk試驗結(jié)果高度一致。因此，在標準試驗組合中，上述試驗系統(tǒng)可互相替換。（3）應(yīng)包含一項遺傳損傷體內(nèi)試驗，以提供一個包括影響受試物遺傳毒性作用的其他相關(guān)因素（吸收、分布、代謝、排泄）的試驗?zāi)Ｐ?。體內(nèi)試驗可另外檢出某些遺傳毒性物質(zhì)（注釋10）?？刹捎脟X類動物造血細胞染色體損傷體內(nèi)試驗或其他合適的體內(nèi)試驗。嚙齒類動物染色體損傷體內(nèi)試驗包括骨髓細胞染色體畸變試驗和骨髓細胞或外周血紅細胞微核試驗。2、推薦的標準試驗組合（1）一項體外細菌基因突變試驗；（2）一項采用哺乳動物細胞進行的體外染色體損傷評估試驗，或體外小鼠淋巴瘤tk試驗；（3）一項采用嚙齒類動物造血細胞進行的體內(nèi)染色體損傷試驗。對于結(jié)果為陰性的受試物，完成上述三項試驗組合通?？商崾酒錈o遺傳毒性。對于標準試驗組合得到陽性結(jié)果的受試物，根據(jù)其治療用途，可能需要進行進一步的試驗。建議采用標準試驗組合并不意味著其他遺傳毒性試驗（如DNA加合物檢測，DNA鏈斷裂、DNA修復(fù)或重組試驗）不合適，這些試驗可作為標準試驗組合以外的供選試驗，以進一步驗證或補充標準試驗組合得到的遺傳毒性試驗結(jié)果。此外，用分子生物學技術(shù)對遺傳毒性作用機制進行研究，將有利于危險度評估。在某些情況下，標準試驗組合中的一項或多項試驗對受試物不適合時，可采用其他替代試驗，但應(yīng)提供充分的科學依據(jù)。標準試驗組合不包括為檢測非整倍體而設(shè)計的特定試驗。但是，從體外和體內(nèi)染色體損傷試驗中可得到非整倍體損傷的信息，如有絲分裂指數(shù)升高、多倍體產(chǎn)生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk試驗對于非整倍體誘導(dǎo)劑的檢測也能提供一些有用的信息。出現(xiàn)上述情況時可能需要進行進一步的試驗。附錄部分簡介標準試驗組合中常用的幾種試驗方法，該部分內(nèi)容只是基本原則，具體試驗時需根據(jù)具體情況具體分析，設(shè)計合適的試驗方法。3、標準試驗組合的調(diào)整標準試驗組合在一些特殊情況下不適合，需要根據(jù)情況進行調(diào)整。（1）在一些情況下，細菌回復(fù)突變試驗不能提供合適的或足夠的信息以評價遺傳毒性，如對細菌毒性過大的受試物（如某些抗生素）和可能或已知可干擾哺乳動物細胞復(fù)制的受試物（如拓撲異構(gòu)酶抑制劑、核苷酸同系物或DNA代謝抑制劑）。在這種情況下，體外試驗部分可改用二種不同類型細胞和二種不同終點（基因突變和染色體損傷）的體外哺乳動物細胞試驗。（2）三項標準試驗組合一般可檢出具有遺傳毒性作用的可疑結(jié)構(gòu)的受試物（注釋11）。但是，對此類結(jié)構(gòu)的受試物，在三項試驗組合中的結(jié)果為陰性時，需要適當增加一些試驗，應(yīng)根據(jù)其化學性質(zhì)、已知反應(yīng)性和代謝資料來選擇附加試驗或調(diào)整實驗方案。（3）對于某些特殊的受試物，如毒代或藥代動力學研究表明不被全身吸收，在標準體內(nèi)遺傳毒性試驗中無法到達靶組織（注釋12）的受試物，如放射影像劑、抗酸鋁合劑和一些皮膚用藥，對這些受試物，標準組合的體內(nèi)試驗難以提供有用的附加信息。若改變給藥途徑也不能提供足夠的靶組織暴露時，可僅根據(jù)體外試驗進行評價。（四）與致癌試驗相關(guān)的附加遺傳毒性試驗1、腫瘤產(chǎn)生的相關(guān)證據(jù)對于標準遺傳毒性組合試驗結(jié)果為陰性而在致癌試驗中出現(xiàn)陽性結(jié)果但不能確定具有非遺傳毒性作用機制的受試物，建議采用合適模型的附加遺傳毒性試驗。為了有助于了解作用機制，附加試驗可以改變體外試驗的代謝活化條件或者進行腫瘤靶器官的遺傳損傷的體內(nèi)試驗（例如：肝UDS試驗，32P-后標記試驗，轉(zhuǎn)基因突變測定，腫瘤相關(guān)基因遺傳改變的分子特征研究）。2、具有特異結(jié)構(gòu)的化合物在極個別情況下，具有特異結(jié)構(gòu)的全新化合物可能會被開發(fā)為新藥。當不進行該化合物的嚙齒類動物長期致癌試驗時，應(yīng)該對其遺傳毒性進行深入評估。四、結(jié)果分析與評價遺傳毒性研究是藥物安全性評價與藥物整體開發(fā)進程的一個有機組成部分，其最終目的在于預(yù)測受試物潛在的遺傳毒性或致癌性。試驗結(jié)果的分析和評價是試驗的必要組成部分，應(yīng)對研究結(jié)果進行科學和全面的分析和評價。在對遺傳毒性試驗結(jié)果進行評價時，應(yīng)結(jié)合受試物的藥學特點、藥效學、藥代動力學和其他毒理學研究的結(jié)果等信息進行綜合分析。中藥、天然藥物還應(yīng)結(jié)合處方組成特點、方中藥味毒性情況、臨床應(yīng)用背景情況等進行綜合分析。試驗結(jié)果的評價最終應(yīng)落實到臨床研究受試者范圍限定、風險效益評估以及必要防治措施的制定和應(yīng)用上。遺傳毒性試驗組合檢測的是主要通過直接的遺傳損傷機制的致癌劑（如絕大多數(shù)已知的人類致癌劑），該類組合無法檢測出非遺傳毒性致癌劑。體外試驗的一些實驗條件，如有限的體外代謝活化能力，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，但是，任何一種遺傳毒性試驗中的陽性結(jié)果并不一定能說明受試物對人體真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。在對體內(nèi)外試驗結(jié)果進行評價時，對陽性或陰性的結(jié)果均應(yīng)予以充分考慮，尤其是在有疑義時。因此，需進行綜合分析和評價。（一）體外試驗結(jié)果的評價1、體外試驗陽性結(jié)果在評價體外試驗陽性結(jié)果的生物學意義時，應(yīng)考慮以下幾個問題：（1）與陰性或溶劑對照數(shù)據(jù)及背景數(shù)據(jù)比較，是否有意義？（2）是否有劑量相關(guān)性？（3）弱或可疑的陽性結(jié)果是否可重現(xiàn)？（4）陽性結(jié)果是否由于體外獨特的代謝活化途徑或體外特殊的活性代謝物所致（注釋13）？（5）結(jié)果是否可歸因于體內(nèi)不存在的體外極端培養(yǎng)條件，如極端的pH值、滲透壓、細胞懸液中的沉淀物？（6）哺乳類動物細胞試驗中，陽性結(jié)果是否僅出現(xiàn)在存活率極低的濃度？（7）陽性結(jié)果是否歸因于某種污染物（當某些化合物不存在可疑結(jié)構(gòu)或僅為弱誘變劑或僅在很高濃度時才有誘變性時，可能發(fā)生該種情形）？（8）某種特定遺傳終點的試驗結(jié)果是否與同類化合物中其他化合物的試驗結(jié)果一致？（9）有無其他可能的情況。通過以上考慮，綜合分析該陽性結(jié)果是否有生物學意義。2、體外試驗陰性結(jié)果在評價體外試驗陰性結(jié)果時，應(yīng)慎重考慮以下問題：（1）受試物的化學結(jié)構(gòu)或已知代謝是否提示采用的標準體外代謝活化技術(shù)（如嚙齒類動物肝臟S9）可能不合適？（2）化合物的結(jié)構(gòu)或已知反應(yīng)性是否提示采用其他檢測方法或系統(tǒng)更合適？（3）有無其他可能的情況。（二）體內(nèi)試驗結(jié)果的評價與體外試驗相比，體內(nèi)試驗方法具有考慮到與人體應(yīng)用相關(guān)的吸收、分布、排泄的優(yōu)點，而且體內(nèi)代謝相對于體外試驗中的代謝系統(tǒng)更具有相關(guān)性，因此，體內(nèi)試驗在遺傳毒性試驗中具有更重要的意義。一些已經(jīng)確證的體內(nèi)方法可用于評價遺傳毒性，其中包括骨髓或外周血細胞遺傳學試驗。若某受試物體外試驗結(jié)果為陰性，一般僅需進行一種體內(nèi)細胞遺傳學試驗。對于在一種或多種體外試驗中顯示有生物學意義的陽性結(jié)果的受試物，在進行一種體內(nèi)細胞遺傳學試驗的基礎(chǔ)上，采用骨髓或外周血以外的組織進行進一步的體內(nèi)試驗可提供更有用的信息（注釋14）。受試物體內(nèi)作用的靶細胞以及體外試驗的檢測終點有助于選擇附加的體內(nèi)試驗。如果體外與體內(nèi)試驗的結(jié)果不一致，對其中的差異應(yīng)采用具體問題具體分析的原則進行考慮和分析。評價受試物的潛在遺傳毒性時，應(yīng)全面考慮各項試驗結(jié)果、體內(nèi)和體外試驗方法的內(nèi)在價值及其局限性。1、體內(nèi)試驗結(jié)果陰性時，確定靶組織暴露水平的原則體內(nèi)試驗結(jié)果的意義與確定受試物在靶組織（注釋12）中有足夠的暴露直接相關(guān)，尤其是當體外試驗顯示出確定的陽性結(jié)果而體內(nèi)試驗結(jié)果為陰性時更為重要。由于靶組織以外的組織中出現(xiàn)了劑量限制性的毒性，因此靶組織中通常很難達到足以誘發(fā)生物學反應(yīng)（如毒性）的濃度。在這種情況下，毒代動力學資料能提示在靶組織中的暴露情況。如果由于受試物在靶組織中利用度很低或蛋白結(jié)合率高等原因以致無法達到足夠的暴露量，此時常規(guī)的體內(nèi)遺傳毒性試驗的意義較小。以下建議適用于骨髓細胞遺傳學試驗，如果用其他靶組織，類似的原則也可采用。對于任何一種體外試驗方法結(jié)果呈陽性、而體內(nèi)試驗結(jié)果為陰性的受試物，應(yīng)采用以下任何一種方法反映受試物在體內(nèi)的暴露水平：（1）通過測定微核試驗中在各劑量組和各采樣時間點骨髓中未成熟紅細胞數(shù)與紅細胞總數(shù)的比例發(fā)生的顯著變化，或通過測定染色體畸變試驗中有絲分裂指數(shù)顯著的降低，間接反映受試物的暴露水平。（2）通過測定血液或血漿中的水平反映受試物相關(guān)物質(zhì)的生物利用度（注釋15）。（3）直接測定骨髓中的受試物相關(guān)物質(zhì)。（4）通過放射自顯影檢測組織暴露水平。對于方法（2）～（4），應(yīng)先在最高劑量或其他相關(guān)劑量采用與骨髓試驗相同的動物種屬品系及給藥途徑進行檢測。若體外試驗未顯示受試物有潛在遺傳毒性，可采用上述任何一種方法，也可用嚙齒類動物吸收、分布、代謝和排泄試驗結(jié)果來確定體內(nèi)（系統(tǒng)）暴露水平。2、生殖細胞誘變劑的檢測遺傳毒性對生殖細胞的影響也極其重要。有關(guān)生殖細胞誘變劑檢測的比較研究結(jié)果顯示，大多數(shù)生殖細胞誘變劑能在體細胞試驗中檢出，而體內(nèi)體細胞遺傳毒性試驗的陰性結(jié)果通?？商崾臼茉囄飳ι臣毎矡o影響。體內(nèi)體細胞試驗結(jié)果為陽性時，在綜合評價及指導(dǎo)用藥時應(yīng)關(guān)注受試物對生殖細胞的影響。（三）綜合分析與評價當遺傳毒性結(jié)果為陽性時，對進入臨床試驗是否安全，應(yīng)考慮所有的安全性資料，包括對所有遺傳毒性資料的全面評價和擬進行的臨床試驗的性質(zhì)。如果這些遺傳毒性試驗的結(jié)果提示無潛在的遺傳毒性，則臨床研究一般可在健康受試者和擬用臨床適應(yīng)癥的病人中進行。對于遺傳毒性試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果、但不直接與DNA發(fā)生作用的受試物，不是全都會帶來明顯的體內(nèi)給藥的風險。因此，當遺傳毒性試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，建議提供有關(guān)遺傳毒性機制的證據(jù)以及這種機制與預(yù)期體內(nèi)暴露的相關(guān)性，或者通過試驗排除藥物為非直接與DNA作用的機制，如證明受試物不使DNA烷化或DNA鏈斷裂。若確認受試物可直接損傷DNA，在極特殊情況下，可能會允許用于危及生命的疾?。ㄈ绨┌Y），但不能在健康受試者中使用。當受試物的標準三項試驗組合中的任何一項試驗結(jié)果為陽性時，建議完成標準試驗組合中的第四種試驗。若結(jié)果模棱兩可，需重復(fù)試驗以確定結(jié)果的可重現(xiàn)性。若一項或多項試驗結(jié)果為陽性，需采用證據(jù)權(quán)衡法（注釋16）、進行作用機制研究或附加的支持性試驗（注釋17）以確認受試物是否會引起遺傳毒性。五、遺傳毒性研究進行的時間通常情況下，對于（1）新的化學藥物；（2）中藥、天然藥物中的：①新的有效成分及其制劑；②新的藥材及其制劑；③新的中藥材代用品；④藥材新的藥用部位及其制劑；⑤處方中含有無法定標準的藥材，或來源于無法定標準藥材的有效部位，以及用于育齡人群并可能對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響的新藥（如避孕藥、性激素、治療性功能障礙藥、促精子生成藥、保胎藥或有細胞毒作用等的新藥），在人體試驗開始前，應(yīng)完成標準組合的遺傳毒性試驗。若出現(xiàn)可疑或陽性試驗結(jié)果，應(yīng)進一步進行其他相關(guān)試驗。對于其他需進行遺傳毒性研究的中藥、天然藥物，如長期毒性試驗中發(fā)現(xiàn)有異常增生、處方中含有高度懷疑的遺傳毒性的藥味或成分等，應(yīng)根據(jù)具體情況提供相應(yīng)的遺傳毒性研究資料，并根據(jù)具體情況來確定所需要進行的遺傳毒性試驗的內(nèi)容及進行的時間。由于中藥制劑尤其是中藥復(fù)方制劑有其特殊性，如含有生藥粉的制劑、不溶物較多、成分復(fù)雜、溶解度較差、pH值等問題，難以進行體外試驗者，可選擇進行合適的體內(nèi)試驗，但必須充分說明理由。八、相關(guān)注釋注釋1：TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重復(fù)序列，其位于相應(yīng)的組氨酸靶位點內(nèi)的突變敏感部位，它們對導(dǎo)致這些移碼熱點中堿基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似，因此該三種菌株可相互代替。注釋2：有將A-T靶位點突變的菌株包含在測試組合中可檢測出一些遺傳毒性致癌劑的相關(guān)文獻報道（如Levin等，1983；Wilcox等，1990）。日本勞務(wù)省對5525種化合物的數(shù)據(jù)庫進行分析（以及由各個制藥公司對較小的數(shù)據(jù)庫進行分析）的結(jié)果表明，約7.5%的細菌誘變劑是由大腸桿菌WP2

uvrA而非4種鼠傷寒沙門氏菌株標準組合檢出。盡管尚未獲得這些化合物對動物致癌性的資料，但它們很可能具有與誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌株標準組合變化的誘變劑同樣的潛在致癌性。注釋3：此處所指最高濃度的確定主要針對化學藥物，因中藥、天然藥物所包含范圍過寬（如有效成分類、有效部位類、中藥復(fù)方類等），情況過于復(fù)雜，在合適時可參考化學藥物的最高濃度的確定原則進行設(shè)計，不合適時需根據(jù)具體情況進行合理的設(shè)計。注釋4：出現(xiàn)這種情況可能是培養(yǎng)基中的血清或S9混合液成分增加了沉淀物的溶解性，也可能是細胞膜脂質(zhì)層易化了細胞對脂溶性物質(zhì)的吸收；此外，某些類型的哺乳類動物細胞具有內(nèi)吞噬作用（如中國倉鼠V79、CHO和CHL細胞），能攝取固態(tài)顆粒，隨后將其分散于胞漿中。某些不溶性化合物也可能含有可溶性的遺傳毒性雜質(zhì)。并且許多不溶性藥物是以混懸液或顆粒狀給予人體的。但是另一方面，沉淀物可能干擾結(jié)果的觀察，并使得暴露的程度難以控制（如用離心方法從暴露介質(zhì)中分離細胞時），或使受試物無法進入細胞與DNA發(fā)生作用。已發(fā)現(xiàn)一些物質(zhì)僅在產(chǎn)生沉淀的濃度范圍內(nèi)才顯示出明確的遺傳毒性，這些物質(zhì)包括化合物的聚合物和混合物、某些多環(huán)苯烴、某些苯丙胺、七氯化合物等。有關(guān)其中一些物質(zhì)的協(xié)作研究結(jié)果表明，它們的遺傳毒性在可溶范圍內(nèi)可被檢出，但在不溶性的范圍內(nèi)明顯增高。注釋5：因微核形成機制與誘導(dǎo)染色體畸變有關(guān)，微核試驗及染色體畸變試驗均可用于篩選斷裂劑。對相同受試物的小鼠微核試驗與大鼠骨髓中期相分析的比較研究表明，在定性（即檢測斷裂劑的能力）和定量（即確定誘導(dǎo)斷裂的最低劑量）這兩方面均高度相關(guān)。采用同種動物進行試驗時，可望得到更為一致的結(jié)果。注釋6：雖然微核的形成源于受試物與紡錘體相互作用導(dǎo)致整條染色體分裂的滯后，但微核試驗無法檢測所有非整倍體誘導(dǎo)劑。更特異的非整倍體畸變檢測方法之一即是采用快速、靈敏的技術(shù)分析個體（嚙齒類動物）分裂間期核中的染色體，如原位熒光分子雜交（FISH）方法。注釋7：鑒于微核和染色體畸變的誘導(dǎo)具有相關(guān)性，因而用雄性動物進行骨髓染色體畸變試驗時，應(yīng)用相同的實驗條件是合理的。外周血微核試驗和體內(nèi)前處理的UDS試驗一樣僅在雄性嚙齒類動物中得到驗證。注釋8：目前被接受的評價哺乳動物細胞基因突變的試驗方法包括小鼠淋巴瘤L5178Y細胞或人淋巴母細胞TK6細胞tk試驗，CHO細胞、V79細胞或L5178Y細胞hprt試驗，AS52細胞gpt試驗。注釋9：對在tk位點誘導(dǎo)的突變體分子分析顯示存在多種遺傳學變化，包括點突變、缺失、移位、重組等。對小集落突變體分析顯示tkb等位基因的缺失是染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的改變或重組的結(jié)果。有證據(jù)表明其他位點，如hprt或gpt也對染色體的大范圍缺失敏感，但由于來源于X染色體的的hprt基因很可能位于生命必需基因（Essentialgenes）的側(cè)面，染色體的大范圍缺失或數(shù)目改變往往不引起突變集落，因此對于檢測多種遺傳學改變，該遺傳位點的靈敏度不如tk位點。注釋10：有少數(shù)明顯的遺傳毒性致癌劑確能被骨髓染色體損傷試驗檢出，但在標準組合選擇的幾對體外試驗中，如細菌回復(fù)突變試驗和一項可選擇的染色體損傷細胞遺傳學評價試驗組合，或細菌突變試驗和小鼠淋巴瘤tk試驗組合，卻得到陰性、弱陽性或相互矛盾的結(jié)果。丙卡巴肼、氫醌、氨基甲酸乙酯、苯等致癌劑即屬于此類。注釋11：某些具有遺傳毒性可疑結(jié)構(gòu)的分子單體與化合物的致癌和/或致突變有關(guān)?？梢山Y(jié)構(gòu)包括烷化親電子中心、不穩(wěn)定過氧化物、芳香胺、偶氮結(jié)構(gòu)、N-亞硝基基團、芳香硝基基團。注釋12：靶組織：此處特指體內(nèi)試驗的檢測目標組織，如小鼠骨髓微核試驗中的骨髓。注釋13：已有文獻報道關(guān)于體內(nèi)和體外試驗結(jié)果之間差異的問題，差異包括：（a）體外形成的代謝產(chǎn)物未必在體內(nèi)形成；（b）活性代謝產(chǎn)物可能在體內(nèi)迅速被解毒而體外則不能；（c）受試物在體內(nèi)可迅速、有效地被排泄等。注釋14：雖骨髓或外周血以外組織進行的體內(nèi)試驗可提供有用的信息，但是至今仍無一種已經(jīng)驗證并廣泛應(yīng)用的檢測基因突變的