控制菌及螨類檢查技術(shù)-藥品中銅綠假單胞菌檢查

項目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務7藥品中銅綠假單胞菌檢查技能點3藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程1.實訓目的掌握銅綠假單胞菌的檢查程序及注意事項。2.實訓要求2.1能按下達的任務要求，完成銅綠假單胞菌檢查的試驗設(shè)計。2.2能根據(jù)試驗設(shè)計完成試驗的準備及試驗的具體操作。2.3能根據(jù)試驗反應的結(jié)果做出正確的結(jié)論。3.儀器、設(shè)備和用具恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、微波爐、電磁爐、勻漿儀、恒溫水浴、電熱干燥箱、電冰箱、366nm紫外燈、蒸汽壓力滅菌器（使用時要進行生物指示劑滅菌效果檢查并應定期請有關(guān)部門檢定）。電子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色計。錐形瓶、滴管、培養(yǎng)皿、試管、量筒、試管及塞、吸管、載玻片、蓋玻片、火柴、記號筆、酒精燈、酒精棉球或碘伏棉球。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程4.培養(yǎng)基和試液、指示液0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、1%鹽酸二甲基對苯二胺試液、鹽酸試液、氯仿、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、溴代十六烷基三甲胺、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（POP瓊脂）、明膠培養(yǎng)基、硝酸鹽胨水培養(yǎng)基。對照用菌液銅綠假單胞菌營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于36±1℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1:106，使對照菌加入量含10～100cfu（一般用量為0.1ml），菌數(shù)測定在做陽性對照實驗用營養(yǎng)瓊脂澆碟或平板涂布經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。5操作方法5.1供試品的取樣量（見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)5.3）。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.2供試液的制備（見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7）。5.3增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基2份，每份100ml，1份加入1:10供試液10ml（相當于供試品1g或1ml）。另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h（必要時可延至48h）。陰性對照菌應無軍生長。5.4分離培養(yǎng)輕輕搖動上述增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)取1～2環(huán)培養(yǎng)液（如有菌膜應挑取之），劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使培養(yǎng)基顯藍綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型等，應注意挑選。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.5純培養(yǎng)供試品分離平板生長6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時，以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應挑取2～3個疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作以下檢查。5.6革蘭染色鏡檢5.6.1革蘭染色以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2-3次（載玻片不燙手）固定。5.6.2鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列。5.7生化試驗用銅綠假單胞菌做生化試驗的陽性對照株。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.7.1氧化酶試驗取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無菌玻璃棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30s內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應。本操作應注意：試驗菌落（苔）必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反映不可靠。試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環(huán)）（白金材料除外）挑取菌落（苔），否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯而胺氧化變色不可用。反應需在有氧條件下進行，勿滴加試劑過多，以免浸沒培養(yǎng)物，使之與空氣隔絕，造成假陰性范性。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.7.2綠膿菌素試驗取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，36℃±1℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內(nèi)加氯仿3～5ml，以無菌玻棒攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在氯仿液內(nèi)。靜置片刻，待氯仿分層，用吸管將氯仿移至另一試管中，加入鹽酸試液（1mol/L）約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為陽性反應，無粉紅色出現(xiàn)為陰性反應。本試驗可用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應于室溫培養(yǎng)1～2天再按上法試驗。凡經(jīng)再次檢驗，綠膿菌素試驗仍為陰性者應繼續(xù)以下試驗。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.7.3硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反應，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。小倒管內(nèi)無氣泡者為陰性反應。5.7.442℃生長試驗以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0.9%無菌氯化鈉液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，立即置42℃±1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務使整個斜面浸沒在水浴中，培養(yǎng)24～48h，斜面如有菌苔生長者為陽性反應；無菌苔生長為陰性反應。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程5.7.5明膠液化試驗以接種針沾取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應接近培養(yǎng)基的底部，于36℃±1℃培養(yǎng)24h。取出放入0～4℃冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性反應；如明膠呈凝固狀，為陰性反應。本試驗應注意：（1）本試驗接種前，培養(yǎng)基應為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種。（2）試驗應同時設(shè)未接種細菌的陰性對照管，與試驗管同時培養(yǎng)并觀察結(jié)果。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程6結(jié)果報告6.1供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。6.2供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42℃生長試驗及明膠液化試驗皆為陽性時，亦報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。6.3

凡與7.1與7.2結(jié)果不符合報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程7注意事項7.1污染銅綠假單胞菌的藥物，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時，宜取2～3個以上菌落，分別進行檢驗，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。7.2

綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應事先測試，選用適宜品牌，試驗時并用陽性菌株作對照試驗。藥品中銅綠假單胞菌檢查試驗操作規(guī)程項目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務7藥品中銅綠假單胞菌檢查知識點7藥品中銅綠假單胞菌檢查方法7.1銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌為假單胞菌屬的模式種。本菌首先從臨床樣本中分離所得，該菌感染使膿汁呈銅銹樣的藍綠色，故命名為銅綠假單胞菌，習稱綠膿桿菌。此菌廣泛分布在土壤、水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌，在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療難度，國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。7.1.1形態(tài)特征

銅綠假單胞菌為革蘭陰性、直或微彎曲的桿菌，無芽孢，無莢膜，有1～3根的單端鞭毛，運動活潑。藥品中銅綠假單胞菌檢查方法7.1.2培養(yǎng)特征

銅綠假單胞菌除在硝酸鹽培養(yǎng)基中以外都是專性好氧。最適生長溫度為35℃，在含硝酸鹽和亞硝酸鹽培養(yǎng)基中于42℃能發(fā)育生長是本菌的特點之一。此菌營養(yǎng)要求不高，基本培養(yǎng)基生長良好，因是專性好氧菌，在培養(yǎng)基表面生長較旺盛，在液體深部發(fā)育不良，在條件適宜的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中生長迅速，24h液面出現(xiàn)菌膜，菌液表面呈現(xiàn)藍綠色或黃綠色水溶性色素，本菌能產(chǎn)生水溶性綠膿色素與熒光素；在固體培養(yǎng)基上形成濕潤，扁平，邊緣不整齊，較大的菌落，并具有生姜味。在血平板上大多數(shù)菌株能形成溶血環(huán)。7.1.3生化反應

銅綠假單胞菌能分解葡萄糖。產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖?；|(zhì)試驗-，尿素酶+，氧化酶+，硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗+，枸櫞酸鹽利用試驗+，不產(chǎn)生H2S，液化明膠試驗+。藥品中銅綠假單胞菌檢查方法7.1.4抵抗力

銅綠假單胞菌對熱抵抗力不強，56℃30min可被殺死。在1%石炭酸、0.2%甲酚皂溶液處理5min可將其殺死。對青霉素，鏈霉素等不敏感，對新霉素、慶大霉素、多黏菌素B輕度或中度敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。本菌對十六烷三甲基溴化銨有抗性，故可用于該菌分離。此外本菌在陳舊培養(yǎng)物極易死亡，保存時須注意。7.2檢查程序供試液的制備見“藥品中微生物總數(shù)的檢查。陽性對照試驗：供試品進行控制菌檢查時，應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查，陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陽性對照試驗的目的：檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。藥品中銅綠假單胞菌檢查方法陰性對照試驗：取稀釋劑10ml加入100ml(或200ml)相應控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中。培養(yǎng)，應無菌生長。陰性對照試驗目的：檢查稀釋劑是否滿足無菌要求及培養(yǎng)條件是否適宜。7.2.1增菌培養(yǎng)

膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，1份加入1:10供試液10ml(相當于供試品1g或1m)；1份加入供試液及陽性對照菌；1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照,于36℃±1℃培養(yǎng)18-24h(必要時可延至48h)。陰性對照菌應無菌生長。7.2.2分離培養(yǎng)

輕輕搖動上述增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液(如有菌膜應挑取之)，劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18-24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使培養(yǎng)基顯藍綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和黏液型等，應注意挑選。藥品中銅綠假單胞菌檢查方法7.2.3純培養(yǎng)

供試品分離平板生長所述典型菌落或呈疑似菌落時，以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應挑取2～3個疑似菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，做以下檢查。7.2.4革蘭染色鏡檢(1)革蘭染色

見大腸埃希菌檢查。(2)鏡檢

銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個、成對或成短鏈排列。7.2.5生化試驗

用銅綠假單孢菌做生化試驗的陽性對照株。7.2.5.1氧化酶試驗

取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無菌玻棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加一滴新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二試胺試液、在30內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗陽性反應。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應。藥品中銅綠假單胞菌檢查方法本試驗應注意：7.2.5.1.1試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應不可靠；7.2.5.1.2試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針(環(huán))(白金材料除外)挑取菌落(苔)，否則易出現(xiàn)假陽性，宜用玻棒或木棒；7.2.5.1.3試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。7.2.5.1.4反應需在有氧條件下進行，勿滴加試劑過多，以免浸沒培養(yǎng)物，使之與空氣隔絕，造成假陽性反應；7.2.5.1.5麥康凱、SS瓊脂培養(yǎng)基等含糖培養(yǎng)基上的菌落，不適于做氧化酶試驗，因為糖分解產(chǎn)酸，抑制氧化酶活性。7.2.5.2綠膿菌素試驗取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，36℃±1℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內(nèi)加三氯甲烷3-5ml，以無菌玻攪碎培養(yǎng)基并充分振搖，使培養(yǎng)物中的藥品中銅綠假單胞菌檢查方法色素完全萃取在三氯甲烷液內(nèi)。靜置片刻，待三氯甲烷分層，用吸管將三氯甲烷移至另一試管中，加入鹽酸試液(1mol/L)振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色即為陽性反應，無粉紅色出現(xiàn)為陰性反應。本試驗可用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應于室溫培養(yǎng)1-2天再按上法試驗。凡經(jīng)再次檢驗