流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件

總覽流式細胞術基本知識流式細胞儀的組成數據采集與分析總覽流式細胞術基本知識1流式細胞技術是什么？流式細胞術在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現多參數分析可檢測的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞，微生物FlowCytometryFlow:FluidCyto:CellMetry:Measurement流式細胞技術是什么？流式細胞術FlowCytometry2流式細胞術檢測樣本0.4um40um流式細胞術檢測樣本0.4um40um3流式細胞術檢測指標

流式細胞術提供的信息：

-相對細胞大小-相對細胞顆粒密度和內部復雜度-染色過細胞的相對熒光強度流式細胞術檢測指標

4細胞結構細胞大小細胞粒度DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量染色體分析細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內細胞因子酶活性激素結合位點細胞受體細胞凋亡在上述信號基礎上的細胞分選流式細胞術的應用細胞結構細胞功能在上述信號基礎上的細胞分選流式細胞術的應用5流式細胞儀組成液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細胞光學系統(tǒng)：產生和收集光學信號電子系統(tǒng)：光信號轉化為電信號，進行信號處理流式細胞儀組成6FluidicsDiagramSheathFlowsheathtankSampleFlowsheathinteriorreservoirwasteinteriorreservoirsheathfiltersampleinjectiontube(SIT)testtubeorplateflowcellinterrogationpointbubblefilterwastetankFluidicsDiagramSheathFlowshe7液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)8光學系統(tǒng)

激發(fā)光學系統(tǒng)包括:-激光器-透鏡和反射鏡，將激光引導到檢測區(qū)域收集光學系統(tǒng)包括:濾光片，將產生的光信號引導到對應的光學接收器光學系統(tǒng)

激發(fā)光學系統(tǒng)包括:9流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件10流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件11光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)12流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件13光學系統(tǒng)-濾光片460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass Shortpass Bandpass光學系統(tǒng)-濾光片46050054046014流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件15流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件16電子系統(tǒng)LaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage電子系統(tǒng)LaserLaserLaserTimeVoltage17電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)18電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)19Review懸浮狀態(tài)的細胞單個流過流動室細胞被激發(fā)產生散射光和熒光信號信號被采集轉換成數字信號存儲于電腦上液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)Review懸浮狀態(tài)的細胞液流系統(tǒng)電子系統(tǒng)20回顧流式細胞儀的三大組成部分？濾光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？回顧流式細胞儀的三大組成部分？21數據采集

三種數據：

-前向散射光FSC-側向散射光SSC-各種熒光散射光FL1，FL2，FL3，FL4數據采集

22當使用激光光源時，在前向方向（和激光行進的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的強度是和細胞或其他檢測顆粒的大小、形狀密切相關的數據采集-前向散射光當使用激光光源時，在前向方向（和激光行進的方向相同）上可用前23當激光光源被使用時，側向也有一定量的散射光產生，可以用90o角的側向散射光檢測通道來采集側向散射光的強度和細胞或其他檢測顆粒的顆粒密度、內部復雜程度密切相關數據采集-側向散射光當激光光源被使用時，側向也有一定量的散射光產生，數據采集-側24外周全血細胞散射光雙參數點圖

顆粒雜質、氣泡對檢測的影響外周全血細胞散射光雙參數點圖

顆粒雜質、氣泡25細胞標記上熒光物質后，這種熒光物質要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)，同時發(fā)出特定波長的光熒光物質被激發(fā)以后產生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收特定檢測是通過光學濾片和透鏡來控制的數據采集-熒光信號熒光強度是和細胞上標記上的熒光染料的量正相關數據采集-熒光信號熒光強度是和細胞上標記上的熒光染料的量正相26數據采集數據采集27電壓

信號放大方式：log、lin信號類型：A,W,H電壓的調節(jié):根據陰性對照管來調節(jié)電壓

信號放大方式：log、lin28閾值可以以任意參數及多個參數的組合作為閾值大多數樣本都可以設定FSC/SSC閾值以下的信號不存儲根據陰性對照管來調節(jié)目的是將不需要的雜質信號，噪音信號，無用的細胞信號等扣除，使收集到的都是有用信號閾值可以以任意參數及多個參數的組合作為閾值29流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件30流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件31補償

補償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補償。補償的調節(jié):根據單染對照管來調節(jié)補償

補償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補償。32流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件33流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件34流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件35流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件36流式細胞儀BD-FACSCanto-II課件371.)Compensation-TooLittle;TooMuch1.)Compensation-TooLittle;382.)BasicPrinciplesofCompensation-%Compensationisindependentoffluorescenceintensity2.)BasicPrinciplesofCompen393.)Compensation-

TooDim,TooBrightCompensationControlsSmallerrorsincompensationofadimcontrol(A)canresultinlargecompensationerrorswithbrightreagents(B&C).3.)Compensation-

40數據分析流式數據直方圖散點圖等高線圖密度圖三維圖統(tǒng)計數據數據分析41直方圖直方圖(DistributionHistogram)橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，單位是對數，可以是線性或對數坐標?？v坐標一般是細胞數。直方圖直方圖(DistributionHistogram)42散點圖散點圖(DotPlot)X坐標為該細胞一參數相對含量，Y坐標為該細胞另一參數的含量，可以將細胞亞群分開。散點圖散點圖(DotPlot)43等高線圖和密度圖等高線圖和密度圖44三維圖