殺菌劑的毒力測定方法

第二章殺菌劑的毒力測定方法完整的殺菌劑生物測定技術(shù)：藥劑毒力測定、定性定量分析、防治效果測定殺菌劑室內(nèi)毒力測定與田間藥效：很一致趨勢一致不一致一致的情況：多菌靈對由鐮刀菌引起的麥類赤霉病和惡苗病。不一致的情況：多菌靈對同樣是由鐮刀菌引起的棉枯黃、萎病菌。完全不一致的情況：室內(nèi)毒力測定，完全不表現(xiàn)活性如：嘧啶胺類化合物在室內(nèi)，以100ug/ml對灰霉病菌孢子沒有抑制作用；300ug/ml對菌絲生長也不能抑制；1ug/ml的濃度在田間使用時，卻能很好的防治灰霉病。藥劑與病菌的作用關(guān)系傳統(tǒng)的：以其“毒力”抑制或殺死病菌。一般是一致的。病菌藥劑環(huán)境新類型的殺菌劑：

影響病菌的致病過程；影響寄主的抗病性；第一節(jié)殺菌劑的培養(yǎng)基毒力測定1孢子萌發(fā)試驗法以觀察供試病菌孢子是否萌發(fā)，來判定殺菌劑的毒力大小。

基本方法：將供試藥劑以一定方法附著在載玻片上，然后將病菌孢子懸浮液滴在其上（或?qū)⑺幰号c病菌孢子懸浮液混合滴于載玻片上），于保濕、定溫的條件下保持一定時間，然后鏡檢觀察孢子萌發(fā)數(shù)量。孢子萌發(fā)試驗法的注意事項：1）潔凈的用具；載玻片表面必須對供試菌無毒、對孢子萌發(fā)無促進作用、并能使液滴擴散一致。2）藥劑附著：混合滴加、先后滴加、精密噴布3）供試菌種菌種純、能產(chǎn)生大量孢子、孢子體形大，在顯微鏡下易觀查、

4）孢了懸浮液的配制

盡可能的使供試菌產(chǎn)生大量孢子（培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)方法和時間）單位容積內(nèi)的孢子數(shù)：50000個/ml左右，依孢子大小，一般在低倍鏡下（接目鏡X10，接物鏡X10），每個視野20-30個孢子。有些孢子較大時還可以適當降低。5）孢子萌發(fā)的條件主要是溫、濕、光、氣、養(yǎng)分等的調(diào)節(jié)，不同病菌孢子所需要萌發(fā)條件是不一樣的。6）孢子萌發(fā)標準一般以孢子萌發(fā)后的芽管大于孢子短半徑時即為萌發(fā)。有些產(chǎn)生游動孢子的則要以孢子囊為空殼的作為萌發(fā)孢子。7）結(jié)果統(tǒng)計不用藥的對照處理，理論上的孢子萌發(fā)率應(yīng)為100%，若不為100%，要對藥劑處理的孢子萌發(fā)率進行校正。

如果對照孢子萌發(fā)率在80%以上時：處理萌發(fā)率（%）校正萌發(fā)率=------------------------X100%

對照萌發(fā)率（%）如果對照的萌發(fā)率較高可采用簡單校正法：

即在各處理組的調(diào)查孢子總數(shù)中增加調(diào)查孢子數(shù)量，增加的數(shù)量根據(jù)對照組孢子萌發(fā)率換算出來。如：CK孢子萌發(fā)率達98%時，在調(diào)查處理組時，擬定調(diào)查數(shù)量為100時，此時就要調(diào)查102個，并對其不萌發(fā)孢子數(shù)減去2，然后計算孢子萌發(fā)率。如果對照的孢子萌發(fā)率低于80%，應(yīng)視為試驗失敗，需重做。8）藥劑抑制病菌孢子的毒力表示：

ED50

但對同一材料不同操作人員或同一操作人員不同時間所作的結(jié)果，可能會出現(xiàn)差異。標準波爾多液的ED50波爾多液系數(shù)=-----------------------------供試藥劑的ED502生長速率測定法

原理：將不同濃度的藥液與溶化的培養(yǎng)基混合，制成帶毒培養(yǎng)基平面，在平面上接種病原菌，以病原菌生長速度快慢判定藥劑毒力大小。生長速率測定法注意事項：1）帶毒培養(yǎng)基的制作應(yīng)先加藥液再加培養(yǎng)基（1：9）；對一些受熱易分解的藥劑則要待培養(yǎng)基冷卻到50度左右時再加入。2）接種病原菌如果是菌絲接種，打孔制作菌餅時取材要從種菌皿的外緣開始，避免使用中心區(qū)的菌絲。如果是孢子液接種，用接種針蘸取孢子液后，在帶藥培養(yǎng)基上劃一直線。3）結(jié)果檢查菌餅接種的結(jié)果檢查：測菌落直徑，對每個菌落采取十字交叉法測兩個直徑，以其均數(shù)代表菌落大小。

CK菌落直徑-處理菌落直徑抑制生長率=----------------------------X100%

CK菌落直徑

處理菌落直徑-菌餅直徑抑制生長率=（1-------------------------------）X100%CK菌落直徑-菌餅直徑3附著法原理：使真菌孢子附著在滅過菌的試驗對象上（如種子、果皮、絹絲、濾紙等），再用相應(yīng)方法使它們接觸藥劑，并給予適宜的發(fā)病條件，一定時間后，觀察有無菌絲生長。

如：濾紙片附著法將真菌孢子懸浮液用一定方法附著于濾紙上，使其接觸不同濃度的藥劑，放在一條件下培養(yǎng)一定時間后，觀察菌絲生長情況。

濾紙打孔干熱滅菌（130℃1h）酒精消毒（70-80%20-30min）

接孢子液帶菌濾紙片入藥液浸漬（10min）置于培養(yǎng)基（2-3d）

觀察有無菌絲產(chǎn)生

4稀釋法在液體或固體培養(yǎng)基中加入含有一系列濃度的供試藥劑，并接種供試菌進行培養(yǎng)，一定時間后，把具有使病菌發(fā)育完全停止的最低濃度稱之為抗菌力的指標。（此法可用于抗菌素的定量測定，也即效價測定）。藥劑抗菌力也即藥劑毒力。5氣體效力測定原理：有些殺菌劑具有揮發(fā)性，且有殺菌特性，在測定這類殺菌劑毒力時，可將麥芽汁-瓊脂培養(yǎng)基置于皿底內(nèi)，冷凝后接種病原菌孢子，然后蓋上皿蓋并倒過來使底成“蓋”，使蓋成“底”，并將殺劑菌劑置于“底”內(nèi)，放到適于病菌孢子發(fā)芽生長的環(huán)境中培養(yǎng)一定時間后觀察。6擴散法原理：在已接種的培養(yǎng)基上加少量的抗菌物質(zhì)，使其接觸培養(yǎng)基和病原菌，經(jīng)一定時間培養(yǎng)后，接觸部分的周圍由于抗菌物質(zhì)的擴散，而產(chǎn)生抑菌圈（或抑菌帶），其大小與藥劑濃度有關(guān)系，以此來比較殺菌劑的毒力大小。此法主要用于抗生素的效價測定。農(nóng)用抗生素的效價效價是衡量抗生素有效成份和質(zhì)量好壞的一個指標。對于一般純凈而穩(wěn)定的物質(zhì)，可以用重量或體積來表示它的含量，但抗生素的成品中有效成份的含量不可能達到100%，而且在加工、貯存過程中有效成份還會遭到破壞，為了保證殺菌效果，必須規(guī)定抗菌素效能的標準。

抗菌素效價的單位最初是用牛津單位。在規(guī)定標準情況下，能在50ml肉汁培養(yǎng)基內(nèi)完全抑制金黃色葡萄球菌（牛津標準菌種）生長時青霉素的最低含量為1個牛津單位。也叫稀釋單位。后來隨著提練技術(shù)的提高，能獲得純凈的青霉素以后，衡量抗菌素的標準也由稀釋單位變?yōu)橹亓繂挝?。世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定：以純凈的芐青霉素鈉鹽的含量作為衡量抗菌素效能的標準，按重量1ug為1個單位。由于過去在青霉素研究工作中，都是采用的稀釋單位，為避免重新?lián)Q算的麻煩，就決定1個牛津單位相當于0.6ug芐青霉素鈉鹽所具有的抗菌效能作為1個國際單位。所以1mg芐青霉素鈉鹽就相當于1667個國際單位。目前，抗菌素效價的衡量單位可分為兩類：1）稀釋單位：將1mg抗菌素配成系列稀釋液，對某一細菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為1mg抗菌素所含的單位。如：1mg抗生素經(jīng)稀釋成一系列濃度后測試，抑制病菌的最高稀釋度為3600倍，那么，這個抗菌素的效價就是3600個國際單位。2）重量單位將純凈的抗菌素直接作為抗菌素效能的衡量單位。即按WHO規(guī)定1ug相當于1個單位。如：純凈的鏈霉素1mg就可以直接標注成1000個單位。第二節(jié)殺菌劑的寄主毒力測定以寄主植物發(fā)病程度來衡量藥劑毒力的測定方法稱殺菌劑的寄主毒力測定包括盆栽、溫室小區(qū)和大田小區(qū)試驗。1噴布用殺菌劑效力測定1.1鮮葉孢子萌發(fā)試驗

摘取植物葉片，先噴布上藥劑，然后再噴上病菌孢子懸浮液（或用毛細管以葉脈為中心一點點的滴下），將處理好的葉片置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)并在適宜的條件下培養(yǎng)一定時間，然后將葉片上的孢子染色風干，用涂有甘油透明膠的蓋玻片蓋到葉片上用以取下葉片上的孢子，鏡檢。1.2葉片接種試驗在附著有藥劑的作物葉片上接種病原菌，一定時間后觀察發(fā)病情況，以判斷藥劑效果。1.3幼苗接種試驗（盆栽試驗）對幼苗經(jīng)接種、噴布藥劑后，一般應(yīng)將幼苗置于接種箱或適當?shù)谋衿髦幸欢〞r間，然后才能取出放到有陽光處或溫室內(nèi)觀察。2種子用殺菌劑的效力測定種子及病菌：從上一年重發(fā)病田中采集帶病種子。土壤：用田間土壤裝缽處理：拌種、浸種涼干后播種效果觀察：出苗后對全部播下的種子都要進行調(diào)查，包括出苗未出苗的。3土壤殺菌劑的效力測定土壤殺菌劑是一類在緩沖作用很大的土壤中表現(xiàn)殺菌效力的殺菌劑。這個測定必須結(jié)合土壤進行。3.1直接法

將風干的土用8目篩過篩，裝入滅菌的玻璃管內(nèi)，裝土厚2.5cm，放入供試菌菌絲或菌核，再裝入土2.5cm，然后注入5ml供試藥劑室溫下培養(yǎng)24h后，取出供試菌菌絲或菌核放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，看能否正常生長。3.2盆栽