ABI公司7900HT型熒光定量PCR儀中文操作手冊

美國應用生物系統(tǒng)公司ABI

7900HTPCR儀操作手冊ABIABIPrism7900HT中文操作手冊2目 錄\l“_TOC_250026“ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊·快速入門 3\l“_TOC_250025“ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊·確定定量 4\l“_TOC_250024“一.開 機 4\l“_TOC_250023“二.建文件 4\l“_TOC_250022“三.探針設置 4\l“_TOC_250021“四.參數(shù)設置 5\l“_TOC_250020“五.填樣品表 6\l“_TOC_250019“六.啟動循環(huán) 7\l“_TOC_250018“七.數(shù)據(jù)分析 7\l“_TOC_250017“八.查看結果 7\l“_TOC_250016“ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊·相對定量 9\l“_TOC_250015“一.開 機 9\l“_TOC_250014“二.建文件 9\l“_TOC_250013“三.探針設置 9\l“_TOC_250012“四.參數(shù)設置 10\l“_TOC_250011“五.填樣品表 1\l“_TOC_250010“六.啟動循環(huán) 12\l“_TOC_250009“七.數(shù)據(jù)分析 12八.設置STUDY 12\l“_TOC_250008“九.查看結果 12\l“_TOC_250007“ABIPRISM7900HT型熒光定量PCR儀簡明手冊·終點讀板 14\l“_TOC_250006“一.開 機 14\l“_TOC_250005“二.建文件 14\l“_TOC_250004“MARKER 15\l“_TOC_250003“四.參數(shù)設置 16\l“_TOC_250002“五.填樣品表 16\l“_TOC_250001“六.終點讀板 16七.數(shù)據(jù)分析 17\l“_TOC_250000“八.查看結果 17ABIPris 7900HT型熒光定量PCR·快速入門開 機WindowsNTAdministrator登陸，密碼7900。待鼠標沙漏消逝，電腦完全啟動后，開7900HT電源，紅橙綠燈2次，然后綠燈點亮。雙擊桌面圖標，翻開SDS應用軟件。建文件FileNewAssayAbsoluteQuantification；終點讀板選AllelicDiscrimination；Container指反響板類型，依據(jù)需要選擇96孔板、384孔板或微量反響卡；Template項用于調(diào)用事先設置好的模板文件；Barcode點OK確認。填樣品表Detector：菜單ToolsDetectorManagerNew建探針，設定名稱、報告基團、淬滅基團等相關參數(shù)；選定探針后點CopytoPlateDocument復制到板文件，指定各個孔所用探針、樣品名和樣品類型〔未知樣品、標準品和比照，標準品并輸入拷貝數(shù)，掃描或輸入條形碼。循環(huán)參數(shù)切換到Instrument窗口，在Thermalprofile選單下設定、修改PCR循環(huán)的溫度、AddADissociationStageSYBRGreenI熒光染料法；保存文件設置完畢，保存文件；也可以保存為模板文件，便利以后調(diào)用。啟動PCRInstrument窗口點擊Open/Close按鈕，彈出樣品架〔在主機的右側。把樣品板Open/CloseStart開頭RemainTime假設干時間后即開頭正式運行。數(shù)據(jù)分析試驗完畢，自動或手工設置基線和閾值，單擊Analyze分析結果，切換到Result窗口查看擴增曲線、標準曲線、原始數(shù)據(jù)、試驗報告等試驗結果。保存數(shù)據(jù)，也可Export各種數(shù)據(jù)。ABIPris 7900HT型熒光定量PCR·確定定量ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀支持使用標準曲線法對核酸進展實時確定定量。一、開機聯(lián)絡。10分鐘以上。電源翻開以后，主機即開頭加熱熱蓋，直到105C。假設熱蓋尚未到達105C就開頭試驗，儀器將自動暫停，等待熱蓋溫度到達后才開頭PCR。翻開電腦顯示屏的電源；啟動電腦；啟動機械臂，電源開關在反面；7900HT2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、建文件啟動軟件SDS軟件：Start→Programs→AppliedBiosystems→SDS2.1SDS2.1。也可以雙擊桌面上的快捷方式圖標啟動SDS軟件。假設使用的是SDSEnterpriseDatabase，登錄時輸入用戶名和密碼，點OK。建文件FileNew。在Assay下拉菜單中選AbsoluteQuantification(StandardCurve)實時定量模式，用于核酸確實定定量爭論)；在Container下拉菜單中依據(jù)需要選擇所用的反響板類型：96384Template下拉菜單中選BlankTemplate。假設只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反響板的條形碼。OK，軟件翻開一個空白的反響板文件。三、探針設置建探針在SDSTools→DetectorManagr翻開DetectorManager窗口。(Detector)DetectorManager對話框中點New，建探針。AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所爭論的基因座的名稱，如GAPDH、RNaseP等。不同探針給以不同的名字。(可選)Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。VIC；TaqMan探針的淬滅基團選TAMRA，MGB探針的淬滅基團選None。Color，在彈出的調(diào)色板中任意選擇一種顏色，點OK。(可選)Notes200字以下說明。設置完成后，點擊OK保存探針并返回DetectorManager頁面。該探針即消滅在探針列表中。1-8，設置更多的探針。復制探針文件探針設置好后，在DetectorManager頁面，從探針列表中選擇探針，或者按住CtrlCopytoPlateDocument按鈕，探針被復制到板文件的WellInspector中。DoneDetectorManager窗口。應用探針在樣品表中，選擇含有第一種探針的全部樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針，該探針即顯示在樣品表的相應孔中。1-2，設置其余樣品所用的探針。設置樣品類型CtrlShift鍵，在樣品表中選擇同一類型的全部樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Task的下拉菜單中選擇樣品類型：空白比照選NTCUnknownStandard準品，還要在QuantityDNA模板的拷貝數(shù)，輸入后按Enter。四、參數(shù)設置SDS軟件的Instrument頁面。依據(jù)需要，選擇或者不選9600Emulation。假設選擇9600Emulation，SDS軟7900HT7700一樣。依據(jù)需要，修改PCR參數(shù)。在7900HT50C2min是UNGUNGPCRPCR造成的污染；假設所用試劑UNG酶，請去掉此步；95C10min的作用是激活金牌Taq酶，同時滅UNGTaq4095C15sec60C1min是定量PCR的循環(huán)步驟。車；增加保溫、循環(huán)或步驟：點擊需要插入步驟處的左邊，消滅粗黑豎線后，點刪除步驟：選中想要刪除的步驟，點擊DeleteStep按鈕。融解曲線試驗：點AddADissociationStage按鈕。注意：融解曲線試驗SYBRGreenI熒光染料法，不適用于熒光探針法。AutoIncrement：每循環(huán)1次，溫度和時間增加或削減肯定幅度，一般不需設定。DataCollectionPCR循環(huán)步驟的平臺線或升降溫線，即消滅信號收集標志；再點擊一次，即消去信號收集標志。最好每一步都收集信號。有關信號收集可以使用默認設置，一般不需要改動。10μL，微量反響卡296孔板大于25384孔板大于5。另外，同一塊板上全部孔的反響體積必需一樣大小。設置參比熒光：假設使用的是ABI公司的定量PCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix，參比熒光(PassiveReference)ROX；假設所用試劑中沒有參比熒光，請選None。五、填樣品表〔可選〕保存為模板菜單File→SaveAs；對于企業(yè)版軟件，選擇File→SaveTemplatetoDatabase。給文件另外取一個名稱。在文件類型下拉菜單中，選SDSTemplates(.sdt)。OK。設置樣品名在反響板上選中含有第一個樣品的全部反響孔。SampleName欄輸入樣品名，回車。12，命名其余樣品。增加或編輯條形碼、備注SDS軟件中，選擇ToolsDocumentInformation。在對話框中編輯條形碼或者備注。完成后，點OK。保存到數(shù)據(jù)庫File下拉菜單項選擇擇SaveDocumenttoDatabase。UniqueName欄輸入文件名，Barcode欄掃描或者輸入條形碼。Comment欄，輸入簡短的文件說明，點OK。SaveDocument對話框，點OK。保存到文件系統(tǒng)SDSFile下拉菜單中選擇SaveAs。選好路徑，在FileName欄輸入文件名，也可以掃描或者輸入條形碼。Save。六、啟動循環(huán)預備好反響板。SDS軟件的Instrument頁面。在Real-Time或者Plate-Read子頁面，點Open/Close，彈出樣品架〔在主機的右側。Open/Close并關閉上樣門。Start等待屏幕上顯示PCR進程和剩余時間后即開頭正式運行。程序完畢后點FileSave保存試驗結果。七、數(shù)據(jù)分析設置基線和閾值：在SDS軟件中，選擇Analysis→AnalysisSettings；在DetectorAnalysisSettings對話框中選擇自動或者手CT

基線(Baseline)的起點和終點確定原則為：起點要避開前面幾個循環(huán)由于Stage2的9C高溫所導致的熒光信號增高〔特別是國產(chǎn)試劑，上升比較明顯36PCR開頭時信號很低、處于本底水平的那個階段；終點要設定在熒光信號有明顯增高處的前面，一般選在本組試驗中最小的CT

3個循環(huán)處；另外起點到終8個循環(huán)。菜單Analysis→Analyze，SDS軟件即開頭分析數(shù)據(jù)，并在Results頁面顯示計算結果。FileSaveResultstoDatabase，保存試驗結果。八、查看結果擴增曲線切換到Result頁面，在AmplificationPlot窗口查看擴增曲線。在ROX和空白校正后的相對熒光信號強度，橫坐標代表PCR循環(huán)次數(shù)〔從1到4線性表示。假設要看完全線性的S形圖譜，請雙擊縱坐標軸線，翻開坐標設置窗口，將縱坐標改成線性形式。原始數(shù)據(jù)切換到Component窗口，查看原始數(shù)據(jù)。正常狀況下，報告基團FAM的信號強度基線時約為4000-5000點，擴增完成后到達約25000-30000S形增長；VIC4000-5000點，擴增完成后15000-20230點，中間也呈S形增長；淬滅基團TAMRA的信號強度基線時比FAM稍低一點，到報告基團開頭指數(shù)增長時它反而會向下降低；ROX信號比FAM的基線水平稍低一點，而且是水平穩(wěn)定的，不隨PCR由于ROX是以固定的濃度參加到PCR試劑中的，并不參與PCR反響。原始數(shù)據(jù)切換到SpectraComponent的區(qū)分是：Component顯示的是信號強度隨時間也就是PCR循環(huán)次數(shù)的變化，是縱向的；Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點上信號強度在不同波長上的分布，8ABIABIPrism 7900HT中文操作手冊是橫向的。標準曲線切換到StandardCurve注意Setup時輸入標準品的拷貝數(shù)后，軟件才能自動生成標準曲線。試驗報告切換到Report窗口，查看試驗報告。確認無誤后，保存結果。也可以從FileExport，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出不同的數(shù)據(jù)，包括信號強度、原始數(shù)據(jù)和試驗結果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel翻開，并可在Excel中重生成擴增曲線、標準曲線等圖譜。ABIABIPrism7900HT中文操作手冊10ABIPris 7900HT型熒光定量PCR·相對定量ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀支持使用C值比較法對核酸進展實時相對T定量。一、開機聯(lián)絡。10分鐘以上。電源翻開以后，主機即開頭加熱熱蓋，直到105C。假設熱蓋尚未到達105C就開頭試驗，儀器將自動暫停，等待熱蓋溫度到達后才開頭PCR。翻開電腦顯示屏的電源；啟動電腦；啟動機械臂，電源開關在反面；7900HT2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、建文件SDS軟件SDS軟件：Start→Programs→AppliedBiosystems→SDS2.1SDS2.1。也可以雙擊桌面上的快捷方式圖標啟動SDS軟件。假設使用的是SDSEnterpriseDatabase，登錄時輸入用戶名和密碼，點OK。建文件FileNew。Assay下拉菜單中選RelativeQuantificationDDCT(實時定量模式，用于核酸的相對定量爭論)；在Container下拉菜單中依據(jù)需要選擇所用的反響板類型：96孔板、384孔板或微量反響卡；在Template下拉菜單中選BlankTemplate。假設只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反響板的條形碼。OK，軟件翻開一個空白的反響板文件。三、探針設置建探針在SDSTools→DetectorManagr翻開DetectorManager窗口。(Detector)DetectorManager對話框中點New，建探針。AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所爭論的基因座的名稱，如GAPDH、RNaseP等。不同探針給以不同的名字。(可選)Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。VIC；TaqMan探針的淬滅基團選TAMRA，MGB探針的淬滅基團選None。Color，在彈出的調(diào)色板中任意選擇一種顏色，點OK。(可選)Notes200字以下說明。設置完成后，點擊OK保存探針并返回DetectorManager頁面。該探針即消滅在探針列表中。1-8，設置更多的探針。復制探針文件探針設置好后，在DetectorManager頁面，從探針列表中選擇探針，或者按住CtrlCopytoPlateDocument按鈕，探針被復制到板文件的WellInspector中。DoneDetectorManager窗口。應用探針在樣品表中，選擇含有第一種探針的全部樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針，該探針即顯示在樣品表的相應孔中。1-2，設置其余樣品所用的探針。設置樣品類型CtrlShift鍵，在樣品表中選擇同一類型的全部樣品孔。在WellInspector對話框中探針列表的Task的下拉菜單中選擇樣品類型：未知樣品選Target；內(nèi)比照〔即管家基因〕EndogenousControl。四、參數(shù)設置SDS軟件的Instrument頁面。依據(jù)需要，選擇或者不選9600Emulation。假設選擇9600Emulation，SDS軟7900HT7700一樣。依據(jù)需要，修改PCR參數(shù)。在7900HT50C2min是UNGUNGPCRPCR造成的污染；假設所用試劑UNG酶，請去掉此步；95C10min的作用是激活金牌Taq酶，同時滅UNGTaq4095C15sec60C1min是定量PCR的循環(huán)步驟。車；增加保溫、循環(huán)或步驟：點擊需要插入步驟處的左邊，消滅粗黑豎線后，點刪除步驟：選中想要刪除的步驟，點擊DeleteStep按鈕。融解曲線試驗：點AddADissociationStage按鈕。注意：融解曲線試驗SYBRGreenI熒光染料法，不適用于熒光探針法。AutoIncrement：每循環(huán)1次，溫度和時間增加或削減肯定幅度，一般不需設定。DataCollectionPCR循環(huán)步驟的平臺線或升降溫線，即消滅信號收集標志；再點擊一次，即消去信號收集標志。最好每一步都收集信號。有關信號收集可以使用默認設置，一般不需要改動。10μL，微量反響卡296孔板大于25384孔板大于5。另外，同一塊板上全部孔的反響體積必需一樣大小。設置參比熒光：假設使用的是ABI公司的定量PCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix，參比熒光(PassiveReference)ROX；假設所用試劑中沒有參比熒光，請選None。五、填樣品表〔可選〕保存為模板菜單File→SaveAs；對于企業(yè)版軟件，選擇File→SaveTemplatetoDatabase。給文件另外取一個名稱。在文件類型下拉菜單中，選SDSTemplates(.sdt)。OK。設置樣品名在反響板上選中含有第一個樣品的全部反響孔。SampleName欄輸入樣品名，回車。12，命名其余樣品。編輯條形碼、備注SDS軟件中，選擇ToolsDocumentInformation。在對話框中編輯條形碼或者備注。完成后，點OK。保存到數(shù)據(jù)庫File下拉菜單項選擇擇SaveDocumenttoDatabase。UniqueName欄輸入文件名，Barcode欄掃描或者輸入條形碼。Comment255字以下的文件說明，點OK。SaveDocument對話框，點OK。保存到文件系統(tǒng)SDSFile下拉菜單中選擇SaveAs。選好路徑，在FileName欄輸入文件名，也可以掃描或者輸入條形碼。Save。六、啟動循環(huán)預備好反響板。SDS軟件的Instrument頁面。Real-TimePlate-ReadOpen/Close，彈出樣品架〔在主機的右側。Open/Close并關閉上樣門。Start等待屏幕上顯示PCR進程和剩余時間后即開頭正式運行。程序完畢后點FileSave保存試驗結果。七、數(shù)據(jù)分析1. SDSAnalysis→Analyze，SDS軟件即開頭分析數(shù)據(jù)，并在Results頁面顯示計算結果。八、設置Study(EnterpriseSoftwareonly)SDSFileSaveResultstoDatabase。Study按鈕。SelectStudy對話框，點New。在Name128Creator不行編輯；在Description255個字。OK。StudyOK。3種狀況下，試驗數(shù)據(jù)被作為SessiondataStudy中：每塊板在定量PCR完成后馬上被附加到Study中；假設使用機械臂，AutomationController軟件在操作過程中自動完成附加；SDSManagerRQManager軟件在分析數(shù)據(jù)的過程中自動完成附加。九、查看結果擴增曲線切換到Result頁面，在AmplificationPlot窗口查看擴增曲線。在ROX和空白校正后的相對熒光信號強度，橫坐標代表PCR循環(huán)次數(shù)〔從1到4S形圖譜，請雙擊縱坐標軸線，翻開坐標設置窗口，將縱坐標改成線性形式。原始數(shù)據(jù)切換到Component窗口，查看原始數(shù)據(jù)。正常狀況下，報告基團FAM4000-5000點，擴增完成后到達約25000-30000S形增長；VIC4000-5000點，擴增完成后15000-20230點，中間也呈S形增長；淬滅基團TAMRA的信號強度基線時比FAM稍低一點，到報告基團開頭指數(shù)增長時它反而會向下降低；ROXFAM的基線水平稍低一點，而且是水平穩(wěn)定的，不隨PCR進程而轉變，ROX是以固定的濃度參加到PCR試劑中的，并不參與PCR反響。原始數(shù)據(jù)切換到SpectraComponent的區(qū)分是：Component顯示的是信號強度隨時間也就是PCR循環(huán)次數(shù)的變化，13ABIABIPrism 7900HT中文操作手冊是縱向的；Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點上信號強度在不同波長上的分布，是橫向的。標準曲線切換到StandardCurve注意Setup時輸入標準品的拷貝數(shù)后，軟件才能自動生成標準曲線。試驗報告切換到Report窗口，查看試驗報告。確認無誤后，保存結果。也可以從FileExport，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出不同的數(shù)據(jù)，包括信號強度、原始數(shù)據(jù)和試驗結果等。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel翻開，并可在Excel中重生成擴增曲線、標準曲線等圖譜。14ABIABIPrism7900HT中文操作手冊ABIPris 7900HT型熒光定量PCR·終點讀板ABIPrism7900HT型熒光定量PCR儀支持各種使用TaqMan探針的等位基因鑒定試驗，包括SNP篩查、基因突變檢測、物種鑒定、+/-檢測、等位基因鑒定等。全部等位基因鑒定試驗都可以分為兩個階段：1、PCR擴增；2、PCR后的熒光信號讀取〔Post-read〕和數(shù)據(jù)處理。第一步既可以在9700、9600等一般的PCR儀上進展70007900PCRPCR儀上進展。以下只表達其次步Post-Read和數(shù)據(jù)處理的操作方法。假設第一步也在定量PCR儀上進展，請按實時定量的試驗方法設置軟件和運行；待PCR完成、數(shù)據(jù)保存好后，再按以下步驟操作。一、開機的通訊聯(lián)絡。10分鐘以上。電源翻開以后，主機即開頭加熱熱蓋，直到105C。假設熱蓋尚未到達105C就開頭試驗，儀器將暫停等待熱蓋溫度到達后才開頭運轉。翻開電腦顯示屏的電源；啟動電腦；啟動機械臂，電源開關在反面；7900HT2次，然后綠燈點亮，說明儀器啟動完畢。二、建文件SDS軟件SDS軟件：Start→Programs→AppliedBiosystems→SDS2.1SDS2.1。也可以雙擊桌面上的快捷方式圖標啟動SDS軟件。假設使用的是SDSEnterpriseDatabase，登錄時輸入用戶名和密碼，點OK。建文件FileNew。Assay下拉菜單中選AllelicDiscrimination；在Container下拉菜單中依據(jù)需96384孔板或384下拉菜單中選BlankTemplate。假設只測一塊板，在Barcode欄掃描或者輸入反響板的條形碼。OK，軟件翻開一個空白的反響板文件。15ABIABIPrism 7900HT中文操作手冊三、設置Detector和Marker建DetectorSDSTools→DetectorManagerDetectorManager窗口。(Detector)DetectorManager對話框中點New，建探針。AddDetector對話框的Name欄輸入探針的名字，建議使用所爭論基因位點的等位基因名稱，如Allele1、Allele2等。(可選)Description欄，輸入簡短的說明，32個字母以下。VIC；TaqMan探針的淬滅基團選TAMRA，MGB探針的淬滅基團選None。Color，在彈出的調(diào)色板中任意選擇一種顏色，點OK。(可選)Notes200字以下說明。設置完成后，點擊OK保存探針并返回DetectorManager頁面。該探針即消滅在探針列表中。1-8，設置更多的探針。建MarkerSDSTools→MarkerManagerMarkerManager窗口。Marker沒有設置好，在MarkerManager對話框中點New，建Marker。MarkerEditor對話框的Name欄輸入Marker的名字，建議使用所爭論的基D3S1169OK，該名稱即消滅在位點列表中。Use項下方框中打Marker所用的Detector。一般每個MarkerDetector，F(xiàn)AM、VIC各一。假設需要，重復步驟3-4，設置更多的Marker。注意：實時定量PCRDetector即可，而SNP試驗必需進一步設Marker，二者有區(qū)分。應用MarkerSDSMarkerManager頁面，在左邊的位點列表中選擇所需Marker，CopytoPlateDocumentMarker3行消滅在WellInspector窗口中。依據(jù)需要連續(xù)選擇其他所需Marker。DoneMarkerManager窗口。在樣品表中，選擇含有第一種Marker的全部樣品孔。MarkerInspector對話框中Marker列表的UseMarkerMarker即顯示在相應的樣品孔中。依據(jù)需要，重復步驟3-4，設置其余Marker。設置樣品類型CtrlShift鍵，在樣品表中選擇同一類型的全部樣品孔。16ABIABIPrism7900HT中文操作手冊WellInspectorMarkerTask下拉菜單中選擇樣品類型：空NTC；全部樣品選Unknown。設置參比熒光：假設使用的是ABI公司的定量PCR試劑，TaqManUniversalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix，參比熒光(PassiveReference)ROX；假設所用試劑中沒有參比熒光，請選None。點擊右上角的X按鈕關閉WellInspector窗口。四、參數(shù)設置SDS軟件的InstrumentPCR60C需要修改。設置反響體積：終點讀板的標準反響體積是：9625μL，3845μL，2μL。同一塊板上全部孔的反響體積必需一樣大小。五、填樣品表〔可選〕保存為模板菜單File→SaveAs