新型大豆苷元苯磺酸酯衍生物的構(gòu)關(guān)系研究

新型大豆苷元苯磺酸酯衍生物的構(gòu)關(guān)系研究

大豆（da1）是大豆的二次代謝產(chǎn)物。根據(jù)近年來的研究，da1具有重要的生理功能，如抗動脈硬化、預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病、降血糖、阻力、抗衰老等。由于傳統(tǒng)加熱法在衍生物大豆苷元-7-苯磺酸酯（D2）上引入烷基十分困難，為提高目標衍生物的產(chǎn)率，采用微波加熱法合成大豆苷元-4′-甲氧基-7-苯磺酸酯（D3）和大豆苷元-4′-乙氧基-7-苯磺酸酯（D4），并D3和D4進行藥學(xué)性質(zhì)研究。利用HPLC測試藥物的溶解度和表觀脂水分配系數(shù)（lgP），以及利用藥物設(shè)計軟件ChemAxon16.1.18對DA1及衍生物的lgP、分子極性表面積、分子可極化率、分子摩爾折射率、氫鍵和解離常數(shù)（pK1材料、試劑和培養(yǎng)基WRR型數(shù)字顯示顯微熔點儀（北京泰克儀器有限公司），溫度計未經(jīng)校正。THZ-22臺式恒溫振蕩器（江蘇太倉實驗儀器設(shè)備廠），XH-MC-1型祥鵠實驗室微波合成反應(yīng)儀。藥物計算軟件ChemAxon16.1.18。Agilent1260HPLC[Agilent1260自動進樣器（G7129A),EC-CDA1純度>98%，購于陜西慧科植物開發(fā)有限公司；青霉素鏈霉素混合液購自Solarbio，生物級二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma；南美胎牛血清（No:11G327）購自Excell,DMEM高糖培養(yǎng)基（No:AD16191265）購自Hyclone。HVSMCs購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。其余試劑為化學(xué)純或分析純。2大豆苷元苯磺酸酯的微波合成D2、D3、D4的常規(guī)方法合成由本實驗室完成2.1硫酸二甲酯3-甲基苯磺酸酯制備66℃時，于100mL燒瓶中加入D20.3586g，丙酮20mL，再加入碳酸鉀0.6295g溶于反應(yīng)液，在劇烈攪拌下加入硫酸二甲酯1.24mL，微波功率300W，回流反應(yīng)55min，薄層層析（TLC）檢測反應(yīng)完成后，抽濾得初產(chǎn)品，柱層析純化流動相為二氯甲烷-丙酮（20∶1），得白色固體0.2674g，產(chǎn)率72%。2.2微波合成丙酮58℃時，于100mL燒瓶中加入D20.7298g，丙酮32mL，再加入由氫氧化鉀0.2168g溶于0.8mL水配成的溶液，10min內(nèi)在劇烈攪拌下滴加硫酸二乙酯0.9mL的丙酮18mL溶液，微波功率200W，回流反應(yīng)30min,TLC檢測反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物置于冰水中，用乙酸乙酯萃?。?5mL×3），用無水硫酸鈉干燥過夜，柱層析純化流動相為二氯甲烷-丙酮（20∶1），得白色固體0.6715g，產(chǎn)率86%。3gp生物活性預(yù)測分別用HPLC測定D3、D4的溶解度和lgP，通過軟件ChemAxon16.1.18對其分子極性表面積、分子可極化率等進行計算，預(yù)測其在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程及生物活性。3.1條件1流動相：乙腈-甲醇（1∶1）；流速：1.0mL·min3.2標準溶液的制備精密稱取D3適量，用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為230μg·mL3.3檢測方法的配置3.3.1色譜條件的測定取“3.2”項下D3、D4質(zhì)量濃度的系列標準溶液，采用“3.1”項下色譜條件進行測定。以待測物質(zhì)量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，得D3、D4的回歸方程：線性范圍分別為0.46～18.4μg·mL3.3.2定量上限loq和檢測下限lod按照“3.2”項下方法制備含D3質(zhì)量濃度為230ng·mL3.3.3測定qc樣品的rsd與re制備D3和D4的低、中、高3個濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品，每一濃度進行六樣本分析，連續(xù)測定3d，計算QC樣品的濃度，與配制濃度對照，求算各成分測定方法的RSD與RE，結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明，D3、D4的日內(nèi)精密度均在12%以內(nèi)，日間精密度小于13%，準確度在-6.6%～13%，均在合理范圍之內(nèi)。3.4表觀脂水分布系數(shù)的測定3.4.1d和d4的lgp脂水分配系數(shù)測定結(jié)果見表3。在所有測定溶劑中，D3、D4的溶解度相對于DA1而言，有極大提高。在環(huán)己烷中，D3溶解度達到124.4μg·mL根據(jù)實驗測定衍生物在水相的濃度ρ由式（1）求出D3、D4的lgP。從表3可以看出，D3、D4的lgP分別為2.73和2.19。D3、D4的lgP均在2.0～3.0之間，處在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)的口服活性藥物最佳范圍，預(yù)示該藥代謝傾向較低和有良好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透作用4藥物：人動脈血管平滑肌細胞的吸收4.1細胞培養(yǎng)和藥物處理取HAVSMCs凍存管復(fù)蘇，取傳代3～10代的HAVSMCs于104.2細胞內(nèi)降清液制備取-80℃冷凍的空白細胞上清液，常溫解凍，渦旋1min，取細胞上清液50μL，加入甲醇50μL，渦流混勻，加入乙酸乙酯1mL，渦流3min,3000r·min4.3條件1流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（1∶1），流速為0.5mL·min4.4系列標準溶液的制備精密稱取DA1適量，用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為2.34mg·mL4.5標準溶液的制備取“4.1”項下冷凍保存的空白細胞上清液25μL，常溫解凍后，分別加入“4.4”項下方法制備不同質(zhì)量濃度的DA1、D3和D4的系列標準溶液25μL，渦流混合，其余同“4.2”項下細胞樣品預(yù)處理”。以待測物濃度X為橫坐標，待測物的峰面積Y為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，得DA1和D3、D4的回歸方程：線性范圍分別為0.293～11.7μg·mL4.5.2洛克斯和洛克斯制備DA1質(zhì)量濃度為293ng·mL4.5.3精密度與準確度取解凍后的空白細胞上清液25μL，加入DA1（或D3、D4）標準溶液25μL，制備低、中、高3個濃度的QC樣品各6份，連續(xù)測定3d，計算QC樣品濃度與配制濃度對比，計算各成分日間和日內(nèi)精密度，結(jié)果見表5，均在合理范圍內(nèi)。4.6加藥細胞預(yù)處理取-80℃冷凍的細胞上清液，常溫解凍，渦旋1min，取加藥細胞上清液50μL，其余同“4.2細胞樣品預(yù)處理”項下方法處理。取處理后的溶液進樣分析。4.7藥物濃度檢測根據(jù)每個分析批建立的標準曲線，計算細胞上清液中藥物濃度。實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，若P<0.05則認為存在顯著性差異，P<0.01則認為有極顯著性差異，P>0.05則沒有顯著性差異。4.8細胞上清液穩(wěn)定性空白HAVSMCs上清液的高效液相色譜圖見圖2-A;DA1培養(yǎng)HAVSMCs0.5h后細胞上清液的高效液相色譜圖見圖2-B，其保留時間為7.331min;D3培養(yǎng)HAVSMCs0.5h后細胞上清液的高效液相色譜圖見圖2-C，其保留時間為12.285min;D4培養(yǎng)HAVSMCs0.5h后細胞上清液的高效液相色譜圖見圖2-D，其保留時間為12.846min。在D3、D4的細胞上清液中未見到DA1，表明D3、D4在細胞培養(yǎng)基中比較穩(wěn)定。以細胞系統(tǒng)培養(yǎng)液中藥物濃度的減少為細胞對藥物的吸收量，由式（1）計算DA1及D3、D4的吸收及其吸收利用率。c5討論5.1da1的氫鍵形成能力DA1與D3、D4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式與最低能量構(gòu)象見圖4（最低能量構(gòu)象由Chemoffice2002搜尋得到），結(jié)構(gòu)特征與藥學(xué)性質(zhì)的實驗與計算結(jié)果見表7。本文主要從改善異黃酮DA1的生物活性出發(fā)，對原藥DA1酯化修飾，改善脂溶性，使其易于穿越細胞膜，從而有可能提高藥物的口服生物利用度和生物活性。適宜的相對分子質(zhì)量對藥物的口服吸收性是重要因素，由表7可知，D3、D4相對分子質(zhì)量分別為408、422，均小于500，符合“Lipinski五倍率法則”由表7可知：D3、D4的氫鍵形成能力相對于原藥DA1而言，分子的氫鍵供體位點從1減少為0，但氫鍵受體位點從9增加到10，表明衍生物的氫鍵成鍵能力增強。修飾后的D3、D4的摩爾折射率均增加，處在40～130之間，符合“Lipinski五倍率法則”由表7可知，經(jīng)修飾后的D3、D4的可極化率與原藥DA1相比均增加。由圖3可知：原藥DA1引入苯磺酸酯基后，在分子中形成正電荷中心。由于S具有很大的可極化率，一方面分子的變形性增加，有利于藥物分子以適當?shù)臉?gòu)型與受體蛋白進行互補性結(jié)合而產(chǎn)生藥效ChemAxon16.1.18的計算結(jié)果表明：D3、D4的分子極性表面積（2D）均為78.9?從表7可以看出：衍生物的lgP由ChemAxon16.1.18的計算值與實驗值差距明顯，可能主要是ChemAxon16.1.18沒考慮到多羥基黃酮的分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致的晶格能較高，從而使其分子親水性很不理想的因素。由表3、7可知，對DA1的苯磺酸酯修飾達到了提高脂溶性的目的，衍生物親脂性的提高，并且衍生物的脂水分配系數(shù)處在適宜的分配系數(shù)1～3之間，符合“Lipinski五倍率法則”由表6可知，D3的細胞吸收率大大提高，相對與原藥DA1最大吸收率提高了3.7倍，說明通過化學(xué)修飾，在DA1的7位上引入苯磺酸酯基，在4’-引入甲基，D3脂溶性提高，同時水溶性也提高了（表3），有利于藥物的吸收。lgP高的衍生物意味著脂溶性強，容易穿越細胞膜，但如果分子的水溶性很低，也不利于分子吸收總之，研究表明，DA1的苯磺酸酯修飾物的藥學(xué)性質(zhì)得以明顯優(yōu)化。對D3、D4而言，適中的相對分子質(zhì)量、增加的親脂親水性、適宜的lgP、低的pK6havsmcs檢測修飾衍生物的合成本文采用微波合成方法成功地合成了DA1苯磺酸酯衍生物，縮短了反應(yīng)時間。在對衍生物的藥學(xué)性質(zhì)研究中，盡管以DA1的親脂性修飾出發(fā)，但意外地發(fā)現(xiàn)部分修飾物的水溶性相對于原藥也有顯著的提高，從而使藥物在HAVSMCs吸收性大幅度提高。D