云粳系列水稻品種分子身份證的構建

云粳系列水稻品種分子身份證的構建

獨特的自然環(huán)境為云南省豐富的水稻資源創(chuàng)造了豐富的自然因素。同時，多樣性的民族文化不斷促進水稻資源的豐富和發(fā)展，使云南省成為中國水稻遺傳多樣性的中心。傳統(tǒng)的品種鑒定方法為田間種植鑒定,主要依據(jù)形態(tài)學性狀對品種進行鑒別區(qū)分。DNA分子標記技術由于不受環(huán)境條件的影響,可從分子水平上對品種的遺傳特異性進行快速、準確地鑒定,克服了傳統(tǒng)形態(tài)標記鑒定周期長、誤差大、性狀差異小的缺點作物分子身份證是品種特異識別的一個標準,以分子標記的多態(tài)性檢測手段為基礎,將DNA指紋進行數(shù)字化編碼賦值本研究以云南省農(nóng)業(yè)科學院選育的35份云粳系列水稻品種為研究材料,采用SSR分子標記技術和熒光測序技術建立云南省粳稻品種指紋圖譜,篩選最佳引物組合,構建35份云粳系列水稻品種的分子身份證,以期用最簡引物組合實現(xiàn)品種的最大程度區(qū)分,減少繁復的工作量和高昂的檢測成本,為云粳系列水稻品種的快速識別提供依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料選取云南省7個育種單位近年來育成的163份粳稻品種、品系作為試驗材料,其中包括35份云粳系列水稻品種。1.2芽播種、育苗每份試驗材料取100粒種子,經(jīng)催芽播種于苗床上,在塑料大棚內(nèi)進行育苗。當幼苗長到四葉一心時,混合取20個單株的葉片,用改良的CTAB法1.3析儀檢測依據(jù)國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準擴增產(chǎn)物在毛細管熒光電泳系統(tǒng)AB3730XLDNA分析儀(AppliedBiosystems,USA)上檢測。用GeneMapperVer.3.7(AppliedBiosystems,USA)對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和校正,讀出每個位點每個樣品的等位變異片段大小數(shù)據(jù)。1.4ssr指紋聚類分析用POWERMARKERVersion3.25軟件分析供試材料指紋圖譜數(shù)據(jù),獲得引物多態(tài)性,并按非加權配對法(UPGMA)采用Nei’s遺傳距離進行聚類分析。篩選出鑒別云粳系列水稻品種的核心引物,讀取云粳系列水稻品種的核心SSR熒光標記的指紋數(shù)據(jù),并對指紋數(shù)據(jù)進行數(shù)字化編碼。再結合品種的基本信息利用二維碼生成軟件將編碼字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨特的條碼標識即分子身份證。2結果2.1云縣系列水稻品種ssr標記多態(tài)性及多樣性分析用30對SSR引物,對163份粳稻品種進行遺傳多樣性檢測。檢測結果(表1)表明,30個多態(tài)性位點共檢測到等位基因207個,每對引物等位基因變幅為2~17,平均等位基因數(shù)為6.6?；蚨鄻有灾笖?shù)變異范圍為0.0244~0.8239,平均為0.4798;多態(tài)信息含量(PIC)的變異范圍為0.02~0.80,平均為0.44。其中,在RM8277、RM336、RM72、RM297和RM219等位點所檢測到的多態(tài)信息指數(shù)較大。分子身份證的構建既要滿足唯一性和可識別(鑒別)性,又要滿足最簡引物組合的要求,否則將會造成構建的分子身份證過于冗繁。因此,有必要單獨對云粳系列水稻品種的指紋圖譜進行分析,篩選可以區(qū)分供試品種的最簡引物組合。云粳系列水稻品種SSR標記多態(tài)性分析結果(表2)顯示,30對SSR引物在35份材料中共檢測到等位基因133個,每對引物檢測到的等位基因數(shù)為1~9個,平均為4個?；蚨鄻有灾笖?shù)變異范圍為0~0.74,平均為0.40;多態(tài)信息含量(PIC)的變異范圍為0~0.72,平均為0.36。在RM8277、RM336、RM1、RM551、RM219、RM1306和RM254等位點所檢測到的遺傳多樣性參數(shù)值較大。對比表1和表2可知,對于不同的群體,引物的多態(tài)信息含量指數(shù)差異較大。2.2鑒別云縣系列水稻品種用1對SSR引物難以將全部云粳系列水稻品種分開,因此選取多態(tài)性信息含量較高的引物(RM8277、RM336、RM551、RM219、RM254、RM1)6對兩兩組合,分析其對云粳系列水稻品種的區(qū)分率。RM336和RM551引物組合分辨率最高,可以區(qū)分17個品種;其次是RM551和RM1引物組合,可以區(qū)分16個品種;再次是RM336和RM219引物組合,可以區(qū)分15個品種。根據(jù)2對引物組合的區(qū)分結果,繼續(xù)增加引物組合的數(shù)量。在增加到5對引物時,可將全部云粳系列水稻品種區(qū)分開來,5對引物為RM8277、RM336、RM551、RM254、RM1。用以上5對引物對供試的163個云南粳稻品種進行分析,該組引物能把云粳系列品種與其他粳稻品種區(qū)分開來。于是利用這5對引物構建云粳系列品種的分子身份證,既滿足唯一性和可識別(鑒別)性,又滿足了最簡引物組合的要求。2.3水稻品種ssr擴增的順序利用可將全部供試云粳系列水稻品種區(qū)分的5對引物進行擴增,構建分子指紋圖譜,圖1為云粳39號在5個SSR位點的分子指紋圖譜。讀取35份水稻品種的5個SSR熒光標記的指紋數(shù)據(jù),按標記所在染色體由小到大排序,即按照RM1、RM8277、RM551、RM336、RM254的順序依次排列。例如,云粳39號的擴增產(chǎn)物在毛細管熒光電泳系統(tǒng)檢測得到的片段大小(bp)為82/84、215/215、171/193、154/154、142/142(水稻為二倍體,SSR擴增只有1條主帶時,須重復記錄一次)。隨著條碼技術的發(fā)展,尤其是二維碼的出現(xiàn),條碼可容納的數(shù)據(jù)量增加,因此直接用按順序排列的片段大小作為品種的分子指紋信息(表3)。再加上水稻品種的基本商品信息,包括作物種類、品種植物學類型、品種繁殖類型、品種名稱、生產(chǎn)經(jīng)營者名稱、審定區(qū)域和審定的年份。最后利用二維碼技術將每份材料的按相同順序排列的字符串轉(zhuǎn)化成每份材料獨特的二維碼標識即分子身份證。例如:云粳39號的二維碼分子身份證見圖2,掃碼后內(nèi)容如圖3。3討論3.1選擇簽名簽名的中心參數(shù)3.2公民身份編碼3.3分子身份證編碼編碼編碼分子身份證與指紋圖譜的功能相同,但分子身份證原則上是以最少特異變異位點或標記為基礎,提取每份種質(zhì)特異的遺傳信息,并通過數(shù)字化處理和軟件分析建立分辨不同種質(zhì)的字符串形式,以達到簡單明了地區(qū)分品種間差異,在品種檢索時更直觀的目的分子