痰熱清注射液在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征研究

痰熱清注射液在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征研究

粘液熱清注射液具有清熱解毒、祛痰止癢的功效。臨床應(yīng)用于風(fēng)熱肺熱阻肺證的氣肺熱阻滯。上述準(zhǔn)備性肺炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎和上呼吸道感染的治療效果是正確的。痰熱清注射液主要活性成分是黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.1、6.6、1.1mg/mL。本實(shí)驗(yàn)iv給予大鼠痰熱清注射液,以處方中上述3個(gè)主要活性成分的血藥濃度經(jīng)時(shí)過(guò)程研究痰熱清注射液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特證,為痰熱清注射液的臨床合理用藥及代謝研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料表面1.1藥品制品對(duì)照品痰熱清注射液(批號(hào)110212),上海凱寶藥業(yè)有限公司提供,10mL/支;黃芩苷(批號(hào)110715-201016)、熊去氧膽酸(批號(hào)110755-9003)、鵝去氧膽酸(批號(hào)110806-200704)、內(nèi)標(biāo)蘆丁(批號(hào)110080-200707)、雙氯芬酸(批號(hào)110334-200302)對(duì)照品,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%,均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈,色譜純,德國(guó)Merck公司;其余試劑均為市售分析純。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其制備SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(190±10)g,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。1.3超純水器和高速冷凍離心器LC—20ADVP高效液相色譜儀、SPD—20A紫外檢測(cè)器、LC-MS2020液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、ESI離子源,日本島津公司;Milli-QGradientA10超純水器,美國(guó)Millipore公司;SPD—2010—230臺(tái)式真空濃縮儀、SorvallStratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo公司;5810R高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;Vortex—2旋渦混合器,美國(guó)ScientificIndustries公司。2方法2.1給藥和樣品采集2.1.1血漿ppendorf-1取大鼠6只,雌雄各半,實(shí)驗(yàn)前禁食12h,自由飲水。從9:00~21:00,每隔2h從眼底靜脈叢取血150μL,置肝素化的Eppendorf管中,4000r/min離心10min,分離血漿,置-20℃冰箱保存待測(cè)。2.1.2血清學(xué)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)檢測(cè)為大鼠實(shí)驗(yàn)前處理(1)單次給藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù)檢測(cè)大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h,自由飲水。取大鼠18只,隨機(jī)分為痰熱清注射液低、中、高劑量(1.25、2.5、5.0mL/kg)組,iv給藥。各組分別于給藥前及給藥后5、10、15、20、30、60、120、240、360min從眼底靜脈叢取血150μL,處理過(guò)程同“2.1.1”項(xiàng)。(2)多次給藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù)檢測(cè)大鼠實(shí)驗(yàn)前處理同(1)。取大鼠12只,隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組,每組6只,雌雄各半。給藥組每天早晚2次ip痰熱清注射液5.0mL/kg,連續(xù)7d;對(duì)照組大鼠ip生理鹽水,最后1次iv生理鹽水。第8天2組均iv5.0mL/kg痰熱清注射液。血樣采集及處理同(1)。2.2條件12.2.1在血漿樣品中測(cè)定黃鼠狼的hplc-紫外層析條件色譜柱為WatersSymmtryC2.2.2材料23mm色譜柱為WatersAtlantisT3(150mm×2.1mm,5μm);預(yù)柱為PhenomennexSecurityGuardCartridgesC2.2.3質(zhì)量分析的條件離子化方式為ESI;掃描方式為SIM;離子模式為負(fù)離子;檢測(cè)離子:熊去氧膽酸[M-H]2.3對(duì)照溶液的制備精密稱(chēng)取黃芩苷、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸等對(duì)照品各適量,用甲醇配制成混合對(duì)照品溶液,三者的質(zhì)量濃度均為0.6mg/mL。2.4內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)蘆丁、雙氯芬酸對(duì)照品各適量,用甲醇配制成1.0mg/mL貯備液,臨用時(shí)用甲醇分別稀釋到25、4μg/mL。2.5不同濃度中麻黃苷的量取痰熱清注射液給藥后1h血漿樣品50μL,加混合內(nèi)標(biāo)10μL(雙氯芬酸4μg/mL,蘆丁25μg/mL)混均后,加甲醇-醋酸乙酯-甲酸(50∶50∶1)混合溶劑900μL,渦旋10min,18000r/min離心2次,每次10min,取800μL上清45℃真空濃縮揮干,甲醇-水(1∶1)100μL復(fù)溶,渦旋5min,18000r/min離心2次,每次10min,取20μL上清進(jìn)樣,LC-UV法測(cè)定黃芩苷的量,取5μL上清LC-MS進(jìn)樣測(cè)定熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的量。2.6方法研究2.6.1專(zhuān)屬性定量測(cè)定在本實(shí)驗(yàn)條件下,大鼠血漿樣品和內(nèi)標(biāo)能較好地分離,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與其他藥物代謝物不干擾測(cè)定,基線(xiàn)噪音小,表明該方法專(zhuān)屬性較好。熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸的基質(zhì)效應(yīng)為85%~115%,表明2種膽酸和內(nèi)標(biāo)無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng),符合生物樣本的LC-MS法測(cè)定。LC-UV測(cè)定黃芩苷及內(nèi)標(biāo)蘆丁的保留時(shí)間分別為9.2、5.6min(圖1)。LC-MS測(cè)定熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸的保留時(shí)間分別為6.2、14.3、5.3min(圖2)。2.6.2血藥濃度的測(cè)定取大鼠空白血漿40μL,加入不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸10μL,使質(zhì)量濃度分別為0、0.078、0.156、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000μg/mL,按“2.5”項(xiàng)下方法處理,用對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)對(duì)血藥濃度(X)作線(xiàn)性回歸。黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸均在0.078~20.000μg/mL具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,定量下限為0.078μg/mL?；貧w方程分別為:黃芩苷Y=1.8908X+0.0223;熊去氧膽酸Y=1.7031X-0.0723;鵝去氧膽酸Y=2.1304X+0.0132。2.6.3樣品穩(wěn)定性測(cè)定血漿樣品室溫放置24h,-20℃反復(fù)凍融3次;-20℃冷凍放置1個(gè)月。結(jié)果表明血漿樣品在儲(chǔ)存及測(cè)定過(guò)程中均穩(wěn)定。進(jìn)樣器放置24h樣品無(wú)明顯變化。對(duì)照品溶液及儲(chǔ)備液在甲醇溶劑中很穩(wěn)定,3個(gè)月內(nèi)無(wú)顯著變化。2.6.4準(zhǔn)確度、精密度和定量限分別配制含黃芩苷0.312、2.500、10.000μg/mL,含熊去氧膽酸或鵝去氧膽酸0.156、1.250、10.000μg/mL的3種對(duì)照品溶液,按“2.5”項(xiàng)處理,記錄對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算質(zhì)量濃度,測(cè)得的質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度的比值即為準(zhǔn)確度。在批內(nèi)和批間精密度試驗(yàn)中,對(duì)3個(gè)質(zhì)量濃度各做5份樣品,測(cè)得黃芩苷、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸3個(gè)質(zhì)量濃度的批內(nèi)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。按照“2.5”項(xiàng)處理3個(gè)質(zhì)量濃度的含藥血漿,并將對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品揮干復(fù)溶后進(jìn)樣分析,計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。2.7藥動(dòng)力參數(shù)的擬合采用WinNonlin6.3軟件對(duì)大鼠體內(nèi)的藥時(shí)曲線(xiàn)進(jìn)行非房室模型擬合,并采用SPSS17.0軟件對(duì)多次給藥和單次給藥間的藥動(dòng)力參數(shù)進(jìn)行比較。3結(jié)果3.1大鼠內(nèi)源性膽酸的時(shí)間序列由于熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸也為內(nèi)源性物質(zhì),其血漿水平存在時(shí)間節(jié)律性,因此首先考察這2種膽酸在正常大鼠體內(nèi)的時(shí)間節(jié)律性3.2單次給藥粘液熱清的藥物動(dòng)力學(xué)分析大鼠單次iv給予痰熱清注射液1.25、2.5、5.0mL/kg后,3個(gè)主要活性成分的t3.3痰熱懸浮液多種給藥的藥物動(dòng)力學(xué)分析大鼠多次iv痰熱清注射液后,黃芩苷、熊去氧膽酸的AUC4血藥濃度結(jié)果由于膽酸結(jié)構(gòu)中缺乏共扼雙鍵系統(tǒng),紫外吸收很弱,在未進(jìn)行衍生化反應(yīng)的情況下,HPLC-UV無(wú)法直接測(cè)定其血漿中的量。為此,本實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS方法測(cè)定熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸在大鼠體內(nèi)的血藥濃度。LC-UV法測(cè)定血漿中黃芩苷的血藥濃度。大鼠單次iv痰熱清注射液2.5mL/kg(相當(dāng)