第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)課件

核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1核磁共振是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要方法優(yōu)點：不需結(jié)晶；可研究動力學。缺點：受分子量限制，需要標記。核磁共振是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種重要方法優(yōu)點：不需結(jié)晶；可研究2MalatesynthaseG(82kDa)MalatesynthaseG(82kDa)3RichardRobertErnst

ErnstwasawardedtheNobelPrizeinChemistryin1991forhiscontributionstowardsthedevelopmentofFourierTransformnuclearmagneticresonancespectroscopyandthesubsequentdevelopmentofmulti-dimensionalNMRtechniques.RichardRobertErnstErnstwas4KurtWüthrich

HewasawardedhalfoftheNobelPrizeinChemistryin2002for"hisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution".KurtWüthrichHewasawardedh5核磁共振的原理自旋量子數(shù)（I）

原子序數(shù)和原子質(zhì)量都為偶數(shù)：I=0(12C,16O)原子序數(shù)為奇數(shù)，原子質(zhì)量為偶數(shù)：I=整數(shù)(14N,2H,10B)原子質(zhì)量為奇數(shù)：I=半整數(shù)(1H,13C,15N,31P)核磁共振的原理自旋量子數(shù)（I）6自旋狀態(tài)（M）M=I,(I-1),(I-2),…,-I

對于1H,13C,15N,31P來說: M=1/2,-1/2自旋狀態(tài)（M）7凡自旋不為零的原子核，在外加靜磁場中發(fā)生能級裂分，共振吸收一特定頻率的射頻電磁場能量的現(xiàn)象，即為核磁共振。Bo=0Bo>0ΔE=γhBo

/2π=hυabγ為磁旋比，由核的性質(zhì)所決定。凡自旋不為零的原子核，在外加靜磁場中發(fā)生能級裂分，共振吸收一8核磁共振的靈敏度

Nα-Nβ

Nα/Nβ=eΔE/kT

ΔE=γhBo/2π對于在400MHz(Bo=9.5T)磁場下的1H：Nα/Nβ=1.000064核磁共振的靈敏度9磁場越強，靈敏度越高磁旋比越大，靈敏度越高γ1H=26.75rad/G；γ13C=6.73rad/G；γ15N=-2.71rad/G核的豐度越高，靈敏度越高第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件10第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件111H譜天然豐度高；靈敏度高。13C譜天然豐度低；靈敏度低；化學位移拓展寬、分辨率好15N譜天然豐度低；靈敏度低；化學位移拓展寬、分辨率好1H譜12核磁共振的頻率

ΔE=γhBo

/2π

υ=γBo

/2π

ΔE=hυ

在常用磁體（2.35-18.6T）下，1H的共振頻率在100-800MHz范圍，13C為它的1/4，15N為它的1/10。10-10 10-810-610-410-2100102wavelength(cm)

g-rays

x-rays

UVVIS

IR

m-waveradio核磁共振的頻率10-10 10-810-613進動(larmor)頻率

ω=2πν

ω0=γB0進動(larmor)頻率14第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件15第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件16第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件17核磁共振的主要參數(shù)化學位移耦合常數(shù)峰強核歐佛豪斯效應（NOE）橫向馳豫時間縱向馳豫時間線寬核磁共振的主要參數(shù)化學位移18化學位移不同的原子處于不同的化學環(huán)境，即處于不同的電磁環(huán)境,因此表現(xiàn)出不同的共振頻率：

υ=γ（Bo±B）/2πω=2πυ=γ(Bo±B)化學位移不同的原子處于不同的化學環(huán)境，即處于不同的19逆磁屏蔽逆磁屏蔽20微磁環(huán)境微磁環(huán)境21Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)Beff=B0-Bloc---Beff=B0(1-σ)22化學位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3化學位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH323AromaticImines AmidesHCb,g,d,...HCawater109876543210AromaticImines AmidesHCb,g,d24影響化學位移的效應：環(huán)流位移效應環(huán)狀分子的大π電子云產(chǎn)生的附加磁場對核的影響順磁離子效應金屬離子對周圍核的影響pH滴定效應不同pH下各基團解離情況的不同對化學位移的影響影響化學位移的效應：25耦合常數(shù)自旋耦合

共價鍵（1-4個鍵）相連核之間的特性張量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond耦合常數(shù)自旋耦合13C1H1H1Hone-bondthree26自旋裂分

由于被測核與相鄰核自旋耦合引起的譜線裂分，裂分的大小稱為耦合常數(shù)aaabbabbI

SSSIIJ(Hz)自旋裂分aaabbabbI SSSIIJ(Hz)27第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件28耦合常數(shù)不隨磁場的變化而變化兩核耦合引起對方譜線裂分的大小相等相距越遠、所隔鍵數(shù)越多，耦合越弱重原子比輕原子耦合強耦合常數(shù)的大小與耦合核的二面角有關(guān)第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件29第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件30峰強、馳豫和線寬峰強與共振粒子數(shù)成正比?？v向馳豫是高能原子核將其多余能量交給周圍介質(zhì)而返回低能態(tài)的過程。橫向馳豫是由于磁場不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁場的不均一，會導致譜線增寬。線寬為橫向馳豫時間的倒數(shù)。分子翻滾速率、溶液粘度和分子內(nèi)部運動性等影響線寬。峰強、馳豫和線寬峰強與共振粒子數(shù)成正比。31縱向馳豫（T1）縱向馳豫（T1）32橫向馳豫（T2）橫向馳豫（T2）33NOE不同核之間通過空間的偶極相互作用，其強度與核間距的六次方成反比。若用射頻照射核A，其譜峰被抑制，與其空間靠近的另一核B的譜峰會略有增強，其增強的程度，即為NOE強弱的度量。因NOE的強度與核間距有關(guān)，所以是分子結(jié)構(gòu)中的最重要參數(shù)。NOE不同核之間通過空間的偶極相互作用，其強度與核間距的六次34一維譜共振峰強度隨頻率（化學位移）變化一維譜共振峰強度隨頻率（化學位移）變化35第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件36二維譜吸收峰強度對兩個頻率變量作圖二維譜吸收峰強度對兩個頻率變量作圖37COSYCOSY38TOCSYTOCSY39NOESYNOESY401H共振的分布1H共振的分布41異核二維譜異核二維譜42多維譜多維譜43多維NMR解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)多維NMR解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)44譜峰認證譜峰認證45自旋體系認證自旋體系認證46第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件47序列認證序列認證48第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件49第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件50NOE認證TOCSY NOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHCNOE認證TOCSY NOESYLeuAla51用于NMR結(jié)構(gòu)計算的約束NOE—5?化學位移—二級結(jié)構(gòu)偶極常數(shù)—二面角氫氘交換—氫鍵順磁馳豫增強(PRE)—遠距離（30?）殘余偶極耦合(RDC)—空間定向用于NMR結(jié)構(gòu)計算的約束52特征NOE與二級結(jié)構(gòu)特征NOE與二級結(jié)構(gòu)53化學位移與二級結(jié)構(gòu)化學位移與二級結(jié)構(gòu)54偶極耦合與二面角偶極耦合與二面角55氫氘交換與結(jié)構(gòu)和氫鍵氫氘交換與結(jié)構(gòu)和氫鍵564.04.0(Has)4.08.0 (NHs) 7.0t=0-NoD2OAddD2Ot=t1t=t24.04.04.08.0 (NHs) 7.0t=57第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件58由核磁數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)由核磁數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)59StrongNOE 1.8-2.7?MediumNOE 1.8-3.3?WeakNOE 1.8-5.0?3JNa<5Hz-80<f<403JNa>8Hz-160<f<-80StrongNOE 1.8-2.7?3JNa<560第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件61核磁共振譜儀的組成MagnetProbeConsoleComputer核磁共振譜儀的組成Magnet62對磁體的要求高磁場強度高穩(wěn)定性高均勻性對磁體的要求63高磁場強度：高分辨率高靈敏度高磁場強度：高分辨率高靈敏度64信噪比的完全方程信噪比的完全方程65第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件66第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件67第五章-核磁共振方法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)ppt課件68樣品的準備溶劑的選擇

1.樣品在其中有高溶解度；

2.在我們所感興趣的波譜范圍內(nèi)沒有溶劑峰；

3.在做變溫實驗的溫度范圍內(nèi)保持液體狀態(tài)。

通常使用一些氘代溶劑

減少溶劑峰的干擾采用氘核內(nèi)鎖穩(wěn)定磁場，起鎖場的作用H2O

是生物分子最適宜的溶劑(90%H2O,10%D2O)樣品的準備溶劑的選擇69蛋白質(zhì)NMR研究的溶液條件pH不要大于7。緩沖體系要保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及高溶解度。蛋白質(zhì)的濃度通常要求有數(shù)mM。避免緩沖液中其他成份對蛋白質(zhì)譜圖的干擾。無機