淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第1頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到刺激物的刺激后可表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。此現(xiàn)象稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡(jiǎn)稱為淋轉(zhuǎn)）。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體的免疫水平，因此可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。原理第2頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有抗原識(shí)別受體和有絲分裂原受體★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可選擇性刺激T細(xì)胞增殖；★脂多糖（LPS）可刺激B細(xì)胞增殖；第3頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離人淋巴細(xì)胞(磁珠分離，流式細(xì)胞術(shù))淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程第4頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)流程

－－PBMC的分離基本原理：由于血液標(biāo)本中各種細(xì)胞比重不同，紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比重為1.092，單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）比重為1.075－1.090；Ficoll比重為1.077±0.001。將血液標(biāo)本置于分層上，經(jīng)離心沉淀，比重高的紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞沉于管底，而比重小的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞懸浮于血漿和分層液的界面層中。第5頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月←ＰＢＭＣ←淋巴細(xì)胞分離液←紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板←血漿第6頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)流程

－－淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)基本原理：在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖；有絲分裂原可作為多克隆刺激劑，使相應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖。第7頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月形態(tài)計(jì)數(shù)法、MTT法、CCK-8法、同位素法。

（一）形態(tài)計(jì)數(shù)法：計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞的比例，計(jì)算轉(zhuǎn)化百分率。（二）MTT法：MTT是一種噻唑鹽?；罴?xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶以MTT為底物，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)ＤＭＳＯ溶解后為紫色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定OD570的值。實(shí)驗(yàn)流程

－－結(jié)果觀察第8頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）3H-TdR摻入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多。該方法與MTT比較，靈敏度高、準(zhǔn)確性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升級(jí)替代產(chǎn)品，可被還原成橙黃色的甲臜，且為水溶性。本方法重復(fù)性好，靈敏度高，對(duì)細(xì)胞的毒性低。

實(shí)驗(yàn)流程

－－結(jié)果觀察第9頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月取靜脈血3ml,用PBS（吸管1）稀釋1倍（滴管1）將稀釋好的靜脈血沿管壁緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min將滴管（滴管2）插入到白膜層，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.棄上清，再洗滌細(xì)胞1次（吸管1）（滴管2）.離心之前計(jì)數(shù)細(xì)胞棄上清,加入完全培養(yǎng)基（吸管2）,重懸細(xì)胞（滴管2）.將細(xì)胞濃度調(diào)整為2*106個(gè)/ml.將細(xì)胞加入96孔板（加樣槍）,100ul/孔A組：加入不同濃度的ConA,100ul/孔.每個(gè)濃度為2復(fù)孔.留2個(gè)孔僅加入培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照.

B組：加入100ulConA(10ug/ml),則終濃度為5ug/ml.4復(fù)孔.設(shè)空白對(duì)照.實(shí)驗(yàn)步驟第11頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h,加入MTT溶液20ul/孔,繼續(xù)培養(yǎng)6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,棄分混勻,測(cè)OD570nm值.

B組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h，制備流式標(biāo)本，上機(jī)檢測(cè)第12頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格中細(xì)胞總數(shù)4×104

×稀釋倍數(shù)第13頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ConA的倍比稀釋10ug/ml5ug/ml2.5ug/ml450μL440μL220μL220μLOriginalsampletubetube1tube2220μL第14頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意無(wú)菌操作操作中盡可能短時(shí)間內(nèi)完成，以減少死細(xì)胞數(shù)將稀釋血加于分離液時(shí)，動(dòng)作要輕柔離心時(shí)，加速度與減速度要均勻平穩(wěn)，不能用離心機(jī)“剎車”檔分離不同種屬動(dòng)物的PBMC要用不同的淋巴細(xì)胞分離液細(xì)胞數(shù)量、刺激劑濃度需要在預(yù)實(shí)驗(yàn)中摸索最適條件注意事項(xiàng)第15頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2009.12.21第16頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）：從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適宜溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下使其生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，亦是生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)和基本技能。第17頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基本要求實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：超凈臺(tái)紫外線消毒30min；無(wú)菌室每周消毒1-2次；所用器材要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。實(shí)驗(yàn)中要求：

?一切操作均要在火焰前方進(jìn)行；瓶口、吸管使用前要經(jīng)過(guò)火焰消毒后使用。

?試劑瓶的瓶口應(yīng)斜放在支架上，試劑用后立即封閉瓶口。

?專管專用。?手不要從敞開的瓶口上方經(jīng)過(guò)。實(shí)驗(yàn)后要求：關(guān)閉超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)；用酒精紗布擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面，紫外線消毒。第18頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)條件合成培養(yǎng)基：根據(jù)體內(nèi)細(xì)胞生存所需的物質(zhì)種類和數(shù)量，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成。常用的培養(yǎng)基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清?？咕兀阂种瓶赡艽嬖诘募?xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)，而不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。常用青、鏈霉素；慶大霉素等。消化液（培養(yǎng)貼壁細(xì)胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH調(diào)整液

NaHCO3溶液：常用濃度為5.6%和7.4%Hepes液：可較長(zhǎng)時(shí)間保持較強(qiáng)的緩沖作用培養(yǎng)條件：無(wú)菌、３７℃、５％ＣＯ２第19頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞原代培養(yǎng)：從供體獲取組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)。原代細(xì)胞離體時(shí)間短，在一定程度上能反映體內(nèi)的生長(zhǎng)特性。適合作藥物測(cè)試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)到一定密度時(shí)，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)?！虘腋∩L(zhǎng)細(xì)胞傳代：離心法√半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：直接吹打法√貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：胰酶消化法第20頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇與運(yùn)輸細(xì)胞的凍存

10％DMSO（低溫保護(hù)劑），20％以上的血清，其余為培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)-1×107個(gè)。二步凍結(jié)法。細(xì)胞的復(fù)蘇

從液氮罐中取出的凍存管，迅速投入37℃水浴中充分搖動(dòng)，使其迅速融化。加入培養(yǎng)液離心后，棄上清，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞的運(yùn)輸

長(zhǎng)距離運(yùn)輸：補(bǔ)充培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋；瓶口用膠帶密封，并用棉花包裹作防震、防壓處理。第21頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)常見污染及處理方