高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定犬血漿中普瑞巴拉濃度及其藥動學(xué)研究

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定犬血漿中普瑞巴拉濃度及其藥動學(xué)研究

普雷巴林（s）-3-（氨基）-5-甲基酸，貨物名lyicaue4d2，圖1）由艾瑞公司于2004年9月在英國上市。隨后,其經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,現(xiàn)用于治療焦慮癥普瑞巴林是具有止痛和抗焦慮活性的內(nèi)源性物質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的結(jié)構(gòu)類似物。當(dāng)GA-BA與GABA受體結(jié)合時,突觸前膜鈣離子的流入減少從而產(chǎn)生突觸前抑制普瑞巴林膠囊目前的每日給藥劑量為150~900mg,每日需要給藥至少2次,患者順應(yīng)性較差。近年來,國內(nèi)外正在進(jìn)行普瑞巴林的緩釋制劑的研究,以期延長藥效,減少服藥次數(shù)及副作用,增加患者順應(yīng)性。而國內(nèi)緩釋制劑的研發(fā),需進(jìn)行臨床前的評價,Beagle犬是臨床前制劑評價的較理想動物模型,所以需建立犬血漿中普瑞巴林定量的分析方法,應(yīng)用于未來的普瑞巴林緩釋制劑的評價工作中。為了研究普瑞巴林的藥代動力學(xué)過程,多種普瑞巴林血漿樣品分析方法已見報道,如HPLC串聯(lián)紫外、熒光檢測器等1材料和方法1.1主要設(shè)備高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(含日本島津高效液相色譜系統(tǒng)(LC-20A)、美國AB質(zhì)譜系統(tǒng)(API40001.2非那西汀普瑞玉林膠囊標(biāo)準(zhǔn)品:普瑞巴林(中國藥品生物制品檢定所,100mg,純度99.80%,批號:101106-201001),非那西汀(美國Sigma公司,100mg,含量98%,批號:V900730);普瑞巴林膠囊(美國輝瑞公司,商品名Lyrica,75mg,批號:J39561);甲醇(HPLC級,德國Merck公司);甲酸(HPLC級,比利時Acros公司);水為Milli-Q超純水。1.3條件1選擇AgilentZORBAX-C1.4普瑞巴多重離子反應(yīng)監(jiān)測選用電噴霧離子源(ESI),設(shè)定源參數(shù)分別為:噴霧電壓(IonSprayVoltage/IS)4500V,輔助氣1(IonSourceGas1/GS1,N2)50Arb,輔助氣2(IonSourceGas2/GS2,N2)55Arb,輔助氣加熱溫度(Temperature/TEM)500℃,氣簾氣(CurtainGas/CUR)30Arb,碰撞氣(CollisionGas/CAD,N2)10Pa。選用正離子模式(Positive)下多重離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM),設(shè)定Q0入口電壓(EntrancePotential/EP)為10V,Q2出口電壓(CollisionCellExitPotential/CXP)為10V。普瑞巴林的MRM參數(shù)為:母離子(Q1Mass)為160.4Da,子離子(Q3Mass)為83.3Da,去簇電壓(DeclusteringPotential/DP)為52V,碰撞電壓(CollisionEnergy/CE)為20eV。內(nèi)標(biāo)(IS)的MRM參數(shù)為:母離子(Q1Mass)為180.3Da,子離子(Q3Mass)為110.2Da,去簇電壓(DeclusteringPotential/DP)為75V,碰撞電壓(CollisionEnergy/CE)為28eV。普瑞巴林及內(nèi)標(biāo)非那西汀的二級掃描質(zhì)譜圖見圖2。1.5樣品制備和樣品處理1.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別精密稱取普瑞巴林及非那西汀對照品5mg,甲醇定容到5mL,配制1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于4℃條件下儲存。普瑞巴林儲備液經(jīng)甲醇逐級稀釋成0.3、1、3、10、30、100μg/mL的工作液;非那西汀經(jīng)甲醇稀釋成3μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液;兩者均存放于4℃條件下待用。1.5.2沉淀蛋白進(jìn)樣、除蛋白樣取Beagle犬血漿50μL置于1.5mLEP管中,加入5μL內(nèi)標(biāo)工作液(3μg/mL),加入1mL甲醇,振蕩5min沉淀蛋白,18000r/min離心5min,轉(zhuǎn)上清液800μL再次18000r/min離心5min后,轉(zhuǎn)移上清液80μL至進(jìn)樣瓶,5μL進(jìn)樣分析。1.5.3標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的預(yù)處理取45μL空白Beagle犬血漿若干份,依次分別加入5μL普瑞巴林系列工作液,振蕩30s,配制成普瑞巴林血漿終濃度分別為30、100、300、1000、3000、10000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,隨后按“1.5.2”項下方法處理,進(jìn)樣5μL,LC-MS/MS分析。質(zhì)量控制樣品由獨(dú)立人員按照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的配制方法,配制80、800、8000ng/mL三個濃度水平的血漿質(zhì)量控制樣品,隨后按“1.5.2”項下方法處理,進(jìn)樣5μL,LC-MS/MS分析。1.6分析的證實(shí)1.6.1純甲醇沉淀蛋白處理前后色圖分析分別選取6份不同來源的空白Beagle犬血漿,將其用20倍體積純甲醇沉淀蛋白處理后進(jìn)樣分析得空白色譜圖。空白Beagle犬血漿中加入普瑞巴林標(biāo)準(zhǔn)工作液或給藥后Beagle犬血漿樣品,按照“1.5.2”項下所述方法處理,得到的色譜圖與空白色譜圖進(jìn)行對照。1.6.2殘留效應(yīng)驗(yàn)證殘留效應(yīng)會影響方法的準(zhǔn)確度和精密度,因此應(yīng)盡量減小或消除殘留效應(yīng),并對殘留效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。在本次方法學(xué)驗(yàn)證中,采用在高濃度樣品后進(jìn)空白樣品的方法對殘留效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。當(dāng)空白樣品中普瑞巴林峰面積低于定量下限樣品中普瑞巴林峰面積20%且內(nèi)標(biāo)殘留不超過5%時,殘留效應(yīng)可忽略不計。1.6.3信度檢驗(yàn)本次驗(yàn)證中對提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的驗(yàn)證選取了80、800、10000ng/mL(n=6)三個濃度進(jìn)行。取6份不同來源的空白Beagle犬血漿,每份血漿按以下三種方式處置后進(jìn)樣分析:方法一:在空白Beagle犬血漿中定量加入普瑞巴林工作液,配制成終濃度分別為80、800、10000ng/mL的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品,隨后按照“1.5.2”項下方法處理后進(jìn)樣分析;方法二:以二十倍體積甲醇對空白Beagle犬血漿沉淀蛋白處理后(振蕩5min),加入5μL內(nèi)標(biāo)工作液(3μg/mL)及5μL普瑞巴林工作液(濃度分別為800、8000、100000ng/mL),振蕩1min,隨后按“1.5.2”項下方法兩次離心處理后進(jìn)樣分析;方法三:以等量超純水代替空白Beagle犬血漿,依前述第二種處置方式,與每份空白血漿平行操作后進(jìn)樣分析。將6份不同來源的空白血漿按前述第一種處置方式處理后測得的普瑞巴林平均峰面積,與其按前述第二種處置方式處理后測得的平均峰面積相比,求算Beagle犬血漿中普瑞巴林的提取回收率;同時,將6份不同來源的空白血漿經(jīng)第二種處置方式處理后測得的普瑞巴林平均峰面積,與用等量超純水代替空白血漿同法操作后測得的平均峰面積相比,求算Beagle犬血漿中普瑞巴林的基質(zhì)效應(yīng)。1.6.4建立普瑞林血漿終濃度回歸模型標(biāo)準(zhǔn)曲線包含一個空白樣品,一個零點(diǎn)樣品和六個非零點(diǎn)樣品?？瞻讟悠窞锽eagle犬空白血漿按“1.5.2”項下處理,處理過程中不添加內(nèi)標(biāo)。零點(diǎn)樣品為Beagle犬空白血漿按“1.5.2”項下處理。非空白樣品制備方法如下:取45μL空白Beagle犬血漿若干份,依次分別加入5μL普瑞巴林系列工作液,振蕩30s,配制成普瑞巴林血漿終濃度分別為30、100、300、1000、3000、10000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品,隨后按“1.5.2”項下方法處理,進(jìn)樣5μL,LC-MS/MS分析。以所測血漿樣品中待測物質(zhì)普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)非那西汀的峰面積比值為因變量,待測物質(zhì)普瑞巴林的血漿終濃度為自變量,進(jìn)行最小二乘法(W=1/x)回歸運(yùn)算,求得普瑞巴林在Beagle犬血漿中的直線回歸方程。按“1.5.2”項下處理標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度樣品30ng/mL(n=5),并進(jìn)樣分析,考察其精密度和準(zhǔn)確度。1.6.5d和相對偏差對精密度和準(zhǔn)確度的考察基于批間和批內(nèi)樣品的變異程度,樣品變異程度以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD和相對偏差RE表示。本次實(shí)驗(yàn)中選取80、800、10000ng/mL(n=6)三個濃度考察分析方法的精密度和準(zhǔn)確度,每個濃度樣品的精密度和準(zhǔn)確度應(yīng)在15%及±15%以內(nèi),定量下限濃度樣品的精密度應(yīng)小于等于20%,而準(zhǔn)確度應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。1.6.6犬血漿穩(wěn)定性的測定在樣品采集和前處理過程中,需要考察普瑞巴林在Beagle犬血漿樣品中的穩(wěn)定性,包括長期凍存穩(wěn)定性(-70℃凍存60d)、室溫放置穩(wěn)定性(室溫放置12h)、凍融穩(wěn)定性(3次反復(fù)凍融)及處理后樣品穩(wěn)定性(4℃進(jìn)樣盤放置24h)。1.6.7建立回算濃度測定由于部分Beagle犬血漿中普瑞巴林的血漿濃度高于所建血漿方法學(xué)的定量上限(10000ng/mL),需要將其適度稀釋后進(jìn)樣分析。本實(shí)驗(yàn)所建稀釋方法如下:取50μL高濃度Beagle犬血漿樣本,按“1.5.2”項下方法處理至一次離心,取10μL上清液,加入90μLBeagle犬血漿稀釋劑(取50μL空白Beagle犬血漿按“1.5.2”項下方法進(jìn)行處理,將多份空白血漿樣本一次離心后所得的上清液混合即為高濃度Beagle犬血漿樣品的稀釋劑),振蕩30s混勻后,二次離心,LC-MS/MS進(jìn)樣分析,根據(jù)當(dāng)日隨行血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回算稀釋上清液中普瑞巴林的測定濃度,將其乘以稀釋系數(shù)(×10)作為原高濃度Beagle犬血漿樣本中普瑞巴林的回算濃度。為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)所建稀釋方法的可靠性,由項目負(fù)責(zé)人指定獨(dú)立人員按“1.5.3”項下方法用空白Beagle犬血漿配制普瑞巴林血漿終濃度介于300~100000ng/mL的高濃度血漿質(zhì)量控制樣本,隨后由血樣分析者按前述稀釋方法處理后進(jìn)樣分析,根據(jù)當(dāng)日隨行血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線與稀釋系數(shù)(×10)回算血漿樣本中普瑞巴林的測定濃度。1.7環(huán)境對大學(xué)生的影響實(shí)驗(yàn)用Beagle犬(6只,體質(zhì)量7.3~9.0kg,雌雄各半)均購自北京馬斯(北京,中國),飼養(yǎng)于12h正常晝夜交替、22~25℃恒溫、濕度介于30%~70%的環(huán)境中。在Beagle犬禁食12h后單次口服給予普瑞巴林膠囊(150mg/只),在給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、30h,從右前肢靜脈叢取血于肝素抗凝的EP管中,經(jīng)8000r/min離心5min后取血漿凍存于-70℃。藥動學(xué)參數(shù)計算依據(jù)軟件WinNonlin(Version6.3,Pharsight,MountainView,CA,USA)非房室模型。2結(jié)果2.1固相色譜檢測內(nèi)源性物質(zhì)的干擾空白血漿樣品色譜圖見圖3(A);加入普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的空白血漿樣品圖3(B)用以評估內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。圖3(C)顯示口服給予普瑞巴林8h后Beagle犬血漿樣品的典型色譜圖。如圖所示,普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為4.0min和4.5min,在分析物保留時間附近沒有發(fā)現(xiàn)干擾峰,說明犬血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物的定量分析。2.2普瑞林峰面積和內(nèi)標(biāo)的殘留在高濃度樣品后進(jìn)樣分析的空白樣品(n=5)中普瑞巴林的峰面積是其定量下限樣品中普瑞巴林峰面積的1.4%,內(nèi)標(biāo)的殘留為0.03%,表明殘留效應(yīng)可忽略不計。2.3提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)普瑞巴林及內(nèi)標(biāo)的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)見于表1。如表1中所示不同濃度(80、800、10000ng/mL)普瑞巴林的提取回收率分別為102.9%、102.0%和101.2%,基質(zhì)效應(yīng)分別為113.0%、106.2%和104.4%。結(jié)果表明此方法提取回收率高且基質(zhì)效應(yīng)不會對犬血漿中普瑞巴林的分析產(chǎn)生影響。2.4計算：2.0.306x,5表1普瑞巴林的標(biāo)準(zhǔn)曲線在30~10000ng/mL范圍內(nèi)線性良好,y=0.000306x+0.000281,r=0.9995。當(dāng)普瑞巴林的濃度為30ng/mL時,其在犬血漿中的信噪比(S/N)遠(yuǎn)大于10,5個樣品的精密度(RSD)為10.9%,相對誤差(RE)為-6.1%。2.5精密度和準(zhǔn)確度普瑞巴林不同濃度(80、800、10000ng/mL)的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。如表2所示,低、中、高濃度的血漿樣品RSD<15%,均符合生物樣品分析的要求。2.6穩(wěn)定性分別考察了3次凍融凍存、-70℃凍存60d、室溫放置12h、處理后4℃進(jìn)樣盤放置24h的穩(wěn)定性,結(jié)果見表3。2.7準(zhǔn)確性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表4所示,三種濃度水平(800、8000、80000ng/mL)的普瑞巴林血漿稀釋質(zhì)量控制樣本的測定結(jié)果準(zhǔn)確性介于95.9%~115.3%。2.8普萊林對狗體內(nèi)藥物動力學(xué)的研究Beagle犬單次口服給予普瑞巴林膠囊后的藥時曲線見圖4。運(yùn)用非房室模型計算的藥動學(xué)參數(shù)見表5。C3討論3.1多離子監(jiān)測參數(shù)設(shè)置首先在ESI正離子模式下進(jìn)行“MSOnly”全掃描,普瑞巴林和非那西汀的母離子,并分別優(yōu)化其去簇電壓(DP),再在“Production”模式下對母離子進(jìn)行轟擊,分別找出每個母離子對應(yīng)的主要碎片離子;最后在“MRM”模式下進(jìn)一步確定CE,從而完成多反應(yīng)監(jiān)測模式