異體獼猴桃間充質(zhì)干細(xì)胞輸注安全性評(píng)價(jià)

異體獼猴桃間充質(zhì)干細(xì)胞輸注安全性評(píng)價(jià)

間充質(zhì)干細(xì)胞（msc）是一種具有多向分裂潛力的干旱性。易于分離和生長(zhǎng)。在幾代擴(kuò)張之后，它仍然可以維持干燥的活性?？煞譃閹追N細(xì)胞，具有支持傷口愈合的能力和特殊的免疫功能，在血液重建、組織修復(fù)和基因治療等領(lǐng)域具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。獼猴是與人最接近的非人靈長(zhǎng)類(lèi)之一,是研究移植的最好模型。本研究觀察了獼猴骨髓來(lái)源MSCs的生物學(xué)特性,評(píng)價(jià)了異體MSCs輸注的安全性和骨髓內(nèi)存活情況,為以后的移植模型和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1動(dòng)物合格號(hào)由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)無(wú)關(guān)健康成年獼猴7只,年齡2~6歲,體質(zhì)量2~8kg,雄性3只,雌性4只,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK-(軍)2002-001。以雄性作為供者,雌性作為受者,雌雄配對(duì)(部分受者用同一雄性供者)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)dmem速眠新0.1ml/kg肌注麻醉,每次從猴股骨穿刺抽取骨髓約5ml,肝素抗凝,用淋巴細(xì)胞分層液(密度1.077g/ml)離心分離(400×g,30min),取白膜以上細(xì)胞部分,PBS洗2次,用DMEM/F12、40%MCDB-201、2%胎牛血清(GibcoBRL,美國(guó))培養(yǎng)液,置37℃,5%CO1.3免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)良好品質(zhì)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs的細(xì)胞表型,簡(jiǎn)述如下:用直接免疫熒光法檢測(cè)獼猴骨髓來(lái)源的MSCs的細(xì)胞表型。為檢測(cè)細(xì)胞表面抗原,將第5代MSCs用胰酶消化后,用含0.5%牛血清白蛋白的PBS洗2次,加入鼠抗人CD29、CD33、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166單抗(BD公司),4℃孵育30min。為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原Flk-1,將細(xì)胞用1%多聚甲醛4℃固定15min,并在室溫下用0.1%的皂角素透膜1h,加入Flk-1單抗,4℃孵育30min。細(xì)胞用PBS洗2次,并懸浮在500μl的PBS中,選用同種同型非相關(guān)IgG抗體作為陰性對(duì)照,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.4外部誘導(dǎo)分布當(dāng)?shù)?代細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),以5×101.5mscs的輸注獼猴分為2組:靜脈輸注組(2只)和骨髓內(nèi)輸注組(2只)。靜脈輸注組:將獼猴固定,選取上肢或下肢靜脈建立靜脈通路,輸注生理鹽水,將培養(yǎng)的MSCs過(guò)4號(hào)針尖(防止細(xì)胞團(tuán)),從靜脈輸入(去除濾器),再用生理鹽水沖管。骨髓內(nèi)輸注:將受體獼猴用速眠新0.05ml/kg肌注麻醉,從猴股骨下段穿刺,抽取骨髓約0.5ml,將重懸于0.5ml生理鹽水的MSCs骨髓內(nèi)注入,再注入0.5ml生理鹽水,拔除骨穿針,局部壓迫5min止血。1.6急性和慢性毒性反應(yīng)及gv解碼輸注后觀察心率、呼吸、血壓、體溫、皮疹、精神、大小便等,以后每周查血常規(guī)、肝腎功能,觀察有無(wú)急、慢性毒性反應(yīng)和GVHD表現(xiàn)。1.7外周血骨髓y特異性序列的檢測(cè)異體輸注后抽取1h、2h、4h、8h、24h、2d、7d、14d、28d、60d的外周血,1d、7d、14d、30d、60d的骨髓,檢測(cè)Y特異性序列;7d、14d、30d、60d抽取骨髓(骨髓內(nèi)輸注組抽取注入側(cè)和對(duì)側(cè)股骨)約3ml,再次培養(yǎng)MSCs,檢測(cè)Y特異性序列,參考文獻(xiàn)2結(jié)果2.1mscs的生物學(xué)特性采用含2%FCS的DMEM/F12,40%MCDB-201培養(yǎng)液培養(yǎng)的獼猴骨髓單個(gè)核細(xì)胞,大部分細(xì)胞于24h內(nèi)即貼壁,倒置顯微鏡下可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈圓形,有小的胞質(zhì)突起72h后,大多數(shù)細(xì)胞有胞質(zhì)突起,部分呈梭形,1周后以梭形細(xì)胞為主,胞質(zhì)豐富,核大,核染色質(zhì)細(xì),核仁明顯,細(xì)胞呈平行或漩渦狀生長(zhǎng),見(jiàn)圖1。獼猴的MSCs較人的稍粗短,連續(xù)傳代10代形態(tài)無(wú)明顯改變。將培養(yǎng)MSCs的上清液進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng),PCR檢測(cè)支原體均為陰性。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)第5代MSCs的細(xì)胞表型:MSCs特異性抗原高表達(dá)(Flk-1:73.71%,CD29:99.81%,CD105:84.0%,CD166:84.2%,CD44:30.66%),造血系抗原低表達(dá)(CD33:0.21%,CD34:0.08%,CD45:4.28%),見(jiàn)圖2。MSCs向成骨分化過(guò)程中,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,紡錘形的突起逐漸消失,胞體增大,形態(tài)近方形或多邊形,部分細(xì)胞呈聚集生長(zhǎng),隨細(xì)胞生長(zhǎng)密度的增長(zhǎng)形成多層的結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu),逐漸形成VonKossa陽(yáng)性的骨結(jié)節(jié)。在脂肪誘導(dǎo)體系中,可見(jiàn)細(xì)胞由成纖維樣逐漸縮短,胞質(zhì)中逐漸出現(xiàn)脂肪滴,脂肪滴逐漸增大、增多,充滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞胞質(zhì),油紅O染色可見(jiàn)紅色的脂肪顆粒,見(jiàn)圖3。2.2急、慢性毒性反應(yīng)及gvhd表現(xiàn)異體MSCs經(jīng)靜脈輸注、髓內(nèi)輸注后,觀察心率、呼吸、血壓、體溫、皮疹、精神、大小便等,隨后觀察2個(gè)月血常規(guī)、肝腎功能,均未見(jiàn)明顯變化,未見(jiàn)急、慢性毒性反應(yīng)和GVHD表現(xiàn),注射局部未見(jiàn)紅腫,下肢活動(dòng)無(wú)障礙。2.3在異體灌溉條件下檢測(cè)y的特異性序列異體靜脈輸注2例,細(xì)胞數(shù)分別為4×103mscs的特異性及其與gvhd的關(guān)系MSCs是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,在造血干細(xì)胞移植中,MSCs可增加造血細(xì)胞植入率、促進(jìn)造血恢復(fù)、抑制免疫,防治GVHD,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景本研究用密度梯度離心和貼壁篩選法分離培養(yǎng)的獼猴MSCs,形態(tài)為典型的成纖維細(xì)胞樣,比人的MSCs稍短粗,細(xì)胞表型測(cè)定為高表達(dá)CD29、CD105、CD166、Flk-1等MSCs特異性標(biāo)志,低表達(dá)CD33、CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)志,與文獻(xiàn)報(bào)道人的MSCs表型相似最近文獻(xiàn)報(bào)道,MSCs表達(dá)MHC-Ⅰ類(lèi)抗原,但僅表達(dá)極少量的MHC-Ⅱ和FasL,不表達(dá)共刺激因子B7-1、B7-2、CD40、CD40L等,因此,免疫原性弱,可跨越MHC屏障,MHC不相合的異體輸注無(wú)毒