雙孢菇中酪氨酸酶的提取與分離

雙孢菇中酪氨酸酶的提取與分離

雙唑菌是世界上最常見、產量最高的細菌。它在中國各地都種植，是中國產量最高的蘑菇。酪氨酸酶（TYR）又稱兒茶酚氧化酶、多酚氧化酶等試驗采用丙酮沉淀，硫酸銨鹽溶鹽析和透析、反滲透相結合的方法提取雙孢菇中的酪氨酸酶并部分純化，研究酶學性質，為雙孢菇采后保鮮、防止褐變、延長貨架期提供依據，同時為美白和烏發(fā)化妝品的開發(fā)提供參考。1材料和方法1.1試劑及儀器雙孢菇（鄭州毛莊菜市場）。丙酮（AR級，安徽宿州化學試劑廠）；硫酸銨（AR級，新鄉(xiāng)市化學試劑廠）；氟化鈉（AR級，萊陽化工實驗廠）；磷酸氫二鈉（AR級，北京紅星化工廠）；磷酸二氫鉀（AR級，萊陽化工實驗廠）。1.2f-c型，高速板式離心紫外分光光度計（SP-2102PC型，上海光譜儀器有限公司）；三用紫外分析儀ZF-C型（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；高速臺式離心機（TGL-18C型，上海安亨科學儀器廠）；離心沉淀器（80-1型，上海手術器械廠）；組織勻漿機（JJ-2型，金壇市億通電子有限公司）；高速冷凍離心機（GL型，湖南儀器儀表總廠離心機廠）。1.3測試方法1.3.1酪氨酸酶液的提取雙孢菇清洗，去水，切塊，按照1︰1比例加入pH6.8磷酸緩沖液，組織勻漿至漿狀，4℃，5000r/min離心15min，棄沉淀，上清液即為粗酪氨酸酶液。粗酶液加等體積丙酮沉淀，同上述條件離心，棄上清，加10%飽和(NH1.3.2對酪氨酸酶活性的測定參照馬慶一等1.3.3關于氨基丙烯酸的研究1酪氨酸酶活力測定測定不同底物濃度下反應速度隨時間的變化。分別取2.0,1.5,1.0,0.8,0.5和0.1mL含2mmol/LL-酪氨酸（底物）的pH6.8磷酸鹽緩沖液，加pH6.8的磷酸緩沖液使總體積均為4mL，加入0.02mL酪氨酸酶液，按1.3.2小節(jié)在317nm比色測定酶活力。2酪氨酸酶活性的測定分別取4mLpH3～8.510種pH的磷酸鹽緩沖液（含1mmol/LL-酪氨酸），25℃保溫10min后，立即加入0.02mL酪氨酸酶液，按1.3.2小節(jié)在317nm比色測定酪氨酸酶的活性。3酪氨酸酶活性的測定反應體系為4mL含1mmol/LL-酪氨酸的pH6.8磷酸鹽緩沖液，在5～60℃不同溫度的水浴中保溫10min后，立即加入0.02mL純化后酶液，混勻后按1.3.2小節(jié)在317nm測定酪氨酸酶活性。4異vc鈉對酶活性的影響以4mL含1mmol/LL-酪氨酸的pH6.8磷酸鹽緩沖液為底物，分別測定無抑制劑、加入0.01%異VC鈉時酶反應速度隨時間的變化，繪制酶反應速度曲線，比較抑制劑對酶活性的影響。2結果與討論2.1提取過程的影響緩沖溶液粗提應在0～4℃下進行，以防止酪氨酸酶失活，緩沖溶液中加入0.1mol/LNaF，以抑制提取過程中酶促反應的進行，防止褐變的發(fā)生，避免酶失活。采用丙酮沉淀酪氨酸酶，整個操作過程控制在0～4℃下進行。2.2蛋白質含量變化粗酶、初步純化酶液和純化后酪氨酸酶的酶活力、蛋白含量、比活力和純化倍數如表1所示。結果表明，在提純過程中，第一步經過丙酮沉淀和硫酸銨鹽溶，酶活提高5倍，而蛋白質含量卻下降近1/2。第二步經過60%飽和硫酸銨鹽析，在蛋白質含量沒有明顯提高情況下，酶活提高近70倍，比酶活提高500余倍，說明經過丙酮沉淀和硫酸銨鹽溶，去除部分雜蛋白。試驗中鹽溶用10%飽和硫酸銨溶液，鹽析中硫酸銨用量60%的飽和度，結果證明這樣可有效去除雜蛋白，純化效果明顯。2.3氨基酸酶的性質2.3.1底物濃度對酶活的影響根據酶活隨底物濃度的變化值，繪制出不同底物濃度酶反應速度曲線，結果如圖1所示。結果表明，底物與酶活呈典型的矩形雙曲線，當底物濃度小于0.4mmol/L時，為一級反應，反應速率和底物濃度呈正比；當底物濃度大于0.804mmol/L時，反應速率趨近最大反應速率，接近零級反應，反應速率不再隨著底物濃度增加而增加。反應動力學符合米氏動力學方程。2.3.2縱坐標實驗結果采用雙倒數作圖法，以1/[s]為橫坐標，以1/V縱坐標作圖，結果如圖2所示。由圖2得出的線性方程y=0.0131x+0.0241可知，直線在y軸上的截距為1/V2.3.3同ph時酪氨酸酶的變化在不同pH條件下，在317nm處吸光度隨時間變化結果，以pH為橫坐標，不同pH時的酶活為縱坐標作圖，結果見圖3。酪氨酸酶的最適pH為6.5，其在pH6.5附近保持較高的活性，在pH6.5以下酶活力與pH呈正相關關系；在pH6.5時達到最大值；大于pH6.5時，酶活力與pH呈負相關關系。2.3.4不同溫度時，不同溫度對產酶的影響不同溫度時，在317nm處吸光度隨時間變化結果，以溫度為橫坐標，不同溫度時的酶活為縱坐標作圖，結果見圖4。酪氨酸酶最適溫度為30℃，其在30℃左右保持較高酶活力，溫度對酶活的影響呈“鐘罩形”曲線。2.3.5測定不同時間的吸光度異VC及對照在317nm處吸光度隨時間變化結果，以時間為橫坐標，不同時間的吸光度為縱坐標作圖，結果見圖5。異VC鈉是常用抗褐變劑，它能有效地抑制酪氨酸酶活性，使反應速度減慢，是