長鏈非編碼rnacs-s對偽狂犬病毒復(fù)制的影響

長鏈非編碼rnacs-s對偽狂犬病毒復(fù)制的影響

豬偽病毒素（prv）是導(dǎo)致豬偽病毒素（pd）引起的疾病，導(dǎo)致仔豬死亡。公豬的體液質(zhì)量下降，失去了使用壽命。她懷孕了祖母，生下了一名教師。這給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNAs,lncRNAs)是不具有編碼蛋白質(zhì)能力、大于200nt的轉(zhuǎn)錄本但是PRV編碼的lncRNA作用機制尚未報道。Tombácz等在感染PRVKaplan株的PK-15細胞中鑒定出2種lncRNA，分別為CTO-L與CTO-S1材料和方法1.1cna3.1和prvea-bac感受態(tài)豬腎上皮細胞PK-15、牛腎上皮細胞MDBK購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)；pEPKan-S2、pcDNA3.1(+)由本實驗室保存；pMDEscherichiacoliGS1783PRVEa-BAC感受態(tài)由本實驗室構(gòu)建并保存?zhèn)慰袢《径魽株(PRVEa)由本實驗室分離并保存。1998年，陳煥春等從湖北省某些豬場大批死亡的新生仔豬的腦及內(nèi)臟中分離到偽狂犬病病毒，并將該毒株命名為豬偽狂病病毒鄂A株1.2引用設(shè)計根據(jù)GenBank(KX423960.1)公布的PRV基因組序列，用Primer5軟件設(shè)計引物(表1)。1.3全race分析與sis1.3.1總rna提取及合成PRVEa感染PK-15細胞24h后Trizol法提取總RNA，以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄引物末端連接oligo(dT)1.3.25.race參考Liu等的Capping-RACE方法1.4pcd3.1-co-s將CTO-S基因全長克隆下來，CTO-S基因的3?末端加上His標(biāo)簽，通過EcoRI/KpnI雙酶切以及酶連的方法將CTO-S基因插入到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1中構(gòu)建pcDNA3.1-CTO-S。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PK-15細胞，24h后收取蛋白樣品進行Westernblotting檢測。1.5缺乏植物和回復(fù)突變植物的構(gòu)建參考Zheng等的研究方法1.6步法繁殖曲線和多步法繁殖曲線參考Yan等的研究方法，測定病毒的一步法增殖曲線以及多步法增殖曲線1.7pk-15細胞的6孔板將病毒以120PFU/孔接種于長滿單層PK-15細胞的6孔板中。2h后每孔覆蓋約1mL含4%羧甲基纖維素鈉和2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37°C、5%CO1.8小鼠磁珠凝膠電泳設(shè)計引物克隆CTO-S全長，并且在5′端連接T7啟動子序列，根據(jù)羅氏生物素標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，合成生物素標(biāo)記的RNACTO-S以及生物素標(biāo)記的反義RNA(作為陰性對照)。將生物素標(biāo)記的RNA與細胞裂解產(chǎn)物以及鏈霉素親和磁珠室溫孵育。蛋白-RNA-磁珠復(fù)合物低速離心，小心移除上清，RIP緩沖液清洗磁珠5遍，小心吸取上清加入5×SDS緩沖液，95°C加熱10min，對樣品進行SDS凝膠電泳并用考馬斯亮藍染色。同時將樣品送公司進行質(zhì)譜分析。1.9prveawt細胞毒性檢測構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-RNAbindingprotein和pcDNA3.1-cytochromeb-c1并且添加HA標(biāo)簽，分別轉(zhuǎn)染至PK-15細胞中，在轉(zhuǎn)染16h后以5MOI接種病毒PRVEaWT，接毒12h后收取細胞裂解液，并取其中一部分作為陽性對照Input組；另一部分上清中加入抗體Anti-HAtag4°C孵育過夜；陰性對照組孵育抗體IgG。再加入20μL充分重懸的proteinA+Gagarose,4°C孵育數(shù)小時；1000×g離心5min，小心移除上清，預(yù)冷的PBS洗滌沉淀5次，小心吸取上清，Trizol法提取RNA,DNaseⅠ消化后進行RT-PCR檢測CTO-S。1.10prvco-s和回復(fù)突變株對大鼠乘子感染的檢測準(zhǔn)備1塊96孔細胞培養(yǎng)板，接種PK-15細胞培養(yǎng)12h。待細胞融合度達到80%，將細胞分為4組，5個孔加入PK-15細胞裂解液作為對照(mock組)；5個孔以5MOI感染PRVEaWT(野毒組)；5個孔以5MOI感染PRVΔCTO-S(突變株組)；5個孔以5MOI感染PRVΔCTO-SR(回復(fù)突變株組)。病毒感染48h后，每孔加20μL的MTT(5mg/mL)，孵育4h，終止培養(yǎng)。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO200μL,37°C孵育30min，至顆粒完全溶解。以對照孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO、無細胞)調(diào)零，酶標(biāo)儀測定490nm的吸光度OD值。GraphPadprism7軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并對測量數(shù)據(jù)進行t-檢驗對分析，P>0.05的統(tǒng)計值被認(rèn)為沒有顯著差異，P<0.05的統(tǒng)計值被認(rèn)為差異顯著，P<0.01的統(tǒng)計值被認(rèn)為差異極其顯著。2結(jié)果與分析2.1to-s的結(jié)構(gòu)利用3′RACE和5′RACE對CTO-S末端進行PCR擴增，擴增片段的測序結(jié)果顯示，CTO-S具有多聚腺苷酸(polyA)尾巴以及帽子(cap)結(jié)構(gòu)，全長為267bp，位于UL22基因和UL21基因之間，3′端與UL22基因3′端相距856bp,5′端與UL21基因3?端相距743bp，與復(fù)制起始位點oriL相鄰，與其相距79bp(圖1)。2.2功能2編碼多肽能力和編碼多肽能力為了研究CTO-S基因編碼蛋白或多肽的能力，首先擴增CTO-S基因全長，在3′端分別加上6×His標(biāo)簽、T+6×His標(biāo)簽和TT+6×His標(biāo)簽3種不同閱讀框模式，將目的片段克隆到pcDNA3.1中(圖2A),Westernblotting結(jié)果顯示CTO-S目的基因蛋白3種閱讀框模式都沒有檢測到相應(yīng)蛋白(圖2B)，說明CTO-S不具有編碼多肽的能力。2.3缺乏植物和回復(fù)突變植物的構(gòu)建2.4樣中co-s對prv復(fù)制的影響在10MOI接毒劑量下，PRVEaWT、rPRVEaΔCTO-S和rPRVEaΔCTO-SR在每個時間點的毒滴度均沒有明顯差異(圖4A)，表明在高劑量接毒情況下，CTO-S對PRV的復(fù)制沒有明顯的影響。在0.01MOI接毒劑量下，CTO-S缺失株與野毒株以及回復(fù)突變株相比，胞內(nèi)以及胞外病毒滴度均沒有顯著差異(圖4B)，表明CTO-S對PRV在PK-15細胞中的組裝和釋放均無影響。野毒株的空斑直徑平均為0.650mm，缺失株空斑直徑為0.649mm，回復(fù)突變株空斑直徑為0.651mm(圖4C)。缺失重組毒與野毒株相比統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異(圖4D)，說明CTO-S缺失株在上皮細胞的橫向擴散能力不受影響。2.5ct-s和cytochromeb-c1cmpes1相互連接2.6突變株與野生株活細胞數(shù)量的比較將細胞分為mock、野毒株、突變株、回復(fù)突變株4組，分別接種細胞裂解液(對照)或感染不同的病毒毒株，48h后MTT法檢測細胞活性，490nm的吸光度OD值越大，則活細胞數(shù)量越多。結(jié)果如圖7所示：與mock組相比，野毒株、突變株、回復(fù)突變株組的活細胞數(shù)量均減少，與野毒株組以及回復(fù)突變株組相比，突變株組的活細胞數(shù)量更多，并且具有顯著性差異。CTO-S缺失后，細胞凋亡減少，說明CTO-S能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。3重組質(zhì)粒的構(gòu)建隨著測序技術(shù)的發(fā)展，長鏈非編碼RNA的功能研究成為熱點。了解CTO-S的真實全長序列能夠為其功能研究奠定基礎(chǔ)。我們首先利用3′RACE和5′RACE鑒定PRVEaWT株中CTO-S的末端序列，CTO-S全長為267bp，該研究結(jié)果為首次報道。研究發(fā)現(xiàn)部分lncRNA可以編碼多肽為了研究CTO-S的功能，利用細菌人工染色體(BAC)技術(shù)以及同源重組的方法成功構(gòu)建出CTO-S缺失株以及回復(fù)突變株。一步法增殖曲線、多步法增值曲線以及空斑大小的結(jié)果均表明CTO-S對于PRV的復(fù)制是非必需的。人類巨細胞病毒表達的5kb的內(nèi)含子lncRNA被證明不影響病毒在成纖維細胞中的復(fù)制為了進一步研究CTO-S的功能，利用RNApulldown聯(lián)合質(zhì)譜的方法篩選與CTO-S互作的宿主蛋白，選擇總肽段覆蓋率高的2個蛋白(cytochromeb-c1complexsubunit1,mitochondrial和RNAbindingprotein)進行RNA免疫共沉淀驗證，結(jié)果表明這2個蛋白能夠與CTO-S互作。但是RNAbindingprotein與RNA的相互結(jié)合不具有特異性，而cytochromeb-c1complexsubunit1是泛醇細胞色素C還原酶復(fù)合物(ubiquinol-cytochromeCreductase)的組分部分，因此又稱ubiquinol-cytochromeCreductasecoreprotein1(UQCRC1)，其是線粒體呼吸鏈的一部分，在呼吸作用ATP的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)研究報道，cytochromeb-c1complexsubunit1還抑制細胞的凋亡。UQCRC1的敲低降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)永生化小鼠精母細胞凋亡Red重組構(gòu)建的CTO-S缺失株以及回復(fù)突變株提取病毒基因組并進行PCR擴增，擴增片段送公司測序，利用Megalign軟件將測序結(jié)果與PRVEaWT基因組序列進行比對。結(jié)果顯示缺失株CTO-S序列成功缺失(圖3A)，得到的病毒命名為rPRVEaΔCTO-S；回復(fù)突變株CTO-S序列成功回復(fù)(圖3B)，命名為rPRVEaΔCTO-SR。CTO-Spulldown篩選CTO-S的互作蛋白進行凝膠電泳(圖5A泳道2),CTO-S反義鏈pulldown的蛋白作為陰性對照(圖5A泳道1)。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，實驗組篩選到907個蛋白，對照組存在813個蛋白，實驗組和對照組重合675個蛋白(圖5B)。其中cytochromeb-c1complexsubunit1與RNA-bindingprotein總肽段覆蓋率高，利用RIP技術(shù)進行進一步的驗證。首先構(gòu)建pcDNA3.1-cytochromeb-c1compl