高溫高壓加熱受試物對細菌回復突變試驗的影響

高溫高壓加熱受試物對細菌回復突變試驗的影響

1受試物影響自1975年建立以來，細菌恢復突變試（以下簡稱ases試驗）已在世界范圍內(nèi)廣泛使用。高溫高壓對含碳水化合物、生物活性成分等類型的受試物影響巨大,經(jīng)過高溫高壓后可能會產(chǎn)生蛋白變性、生物活性降低或喪失、有效成分揮發(fā)等情況,雖然大部分致畸物(致癌物)化學性質都比較穩(wěn)定,但經(jīng)過高溫高壓后可能會揮發(fā)、解離或產(chǎn)生構型變化。這很可能影響Ames試驗對受試物評價的客觀性和科學性。為了研究高溫高壓滅菌對評價受試物致畸性的影響,本研究采用Ames試驗常用陽性物為對象,水及保健食品為基質經(jīng)高溫高壓處理后,研究陽性物誘導自發(fā)回變的效率變化情況。2材料和方法2.1菌株和標準物0.5mmol/L組氨酸-生物素溶液(誘變實驗用,L-組氨酸購自西格瑪,D-生物素溶液購自國藥集團);頂層瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司,氯化鈉購自國藥集團);底層培養(yǎng)基(瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖溶液購自北京索萊寶科技有限公司;磷酸鹽購自國藥集團);北京陸橋的營養(yǎng)肉湯;美國millipore的0.22nm無菌濾器;上海治宇醫(yī)療器械有限公司的10mL無菌注射器;美國康寧的50mL離心管。標準菌株全部來自于MOLTOX,名稱及菌株編號如下:TA97(4710D)、TA98(4703D)、TA100(4711D)、TA102(4712D);陽性物名稱、來源及批號如下:甲基磺酸甲酯(百靈威、L650043);敵克松(Sigma-Aldrich、SZBDO22xv);1,8-二羥蒽醌(百靈威、LS30N53);2-氨基芴(索萊寶、131B102);疊氮鈉(索萊寶、809B053);2-氨基蒽(Sigma-Aldrich、XTBD3302V)。2.2u3000競爭優(yōu)勢MS205DU型電子天平(瑞士梅特勒-托勒多國際有限公司);MLS3780型高壓滅菌鍋(日本三洋電機公司);1300系列A2級生物安全柜(美國賽默飛世爾科技有限公司);KB115型生化培養(yǎng)箱(德國BINDERGmbH公司)。2.3實驗方法依據(jù)GB15193.4-2014《食品安全國家標準細菌回復突變試驗》平板摻入法及相關文獻2.3.1陽性物的致突變作用采用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535為試驗菌株,甲基磺酸甲酯、敵克松、疊氮鈉、二氨基蒽、1,8-二羥蒽醌、2-氨基芴6種陽性物配制見表1,S9作為體外代謝活化系統(tǒng)。同時設溶劑對照,根據(jù)陽性物不同為水或二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。將高壓滅菌后的陽性物和經(jīng)濾菌處理的陽性物分別摻入菌液并接種平板,觀察2種陽性物的致突變作用。每個濃度做三皿平行,整個試驗在相同條件下進行2次,結果為2次平均值。2.3.2陽性物的篩選采用TA97、TA98、TA100、TA102為試驗菌株,S9作為體外代謝活化系統(tǒng)。將甲基磺酸甲酯、敵克松、1,8-二羥蒽醌、2-氨基芴4種陽性物按表1配制后等體積混合作為陽性物。設原液組、2倍、4倍、8倍稀釋4個濃度組,同時設溶劑對照(根據(jù)陽性物不同為水或DMSO)、推薦陽性物組(同表1濾菌陽性物組)。將高壓滅菌后的混合陽性物和經(jīng)濾菌處理的混合陽性物分別摻入菌液并接種平板,觀察2種陽性物的致突變效力。每個濃度做三皿平行,整個試驗在相同條件下進行2次,結果為2次平均值。2.4模擬正常的實驗環(huán)境以無致突變作用的瑪咖片為基質3結果與分析3.1加熱對不同陽性物的誘導突變作用根據(jù)GB15193.4-2014《食品安全國家標準細菌回復突變試驗》判定受試物有致突變作用時,回變率要增加一倍以上,因此本文采用50%為結果判定標準;同時為了研究加熱對致畸物的影響,將Ames試驗中推薦的陽性物直接作為研究對象,按2.3.1方法進行實驗,結果見表3。表3顯示,所有菌的溶劑對照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),不加熱陽性物組的自發(fā)回變菌超過陽性物回變的最低值;證明本試驗體系良好。加熱后除二氨基蒽對TA1535加S9組的回變率有所增加為119%,其余陽性物的回變率均降低。其中最顯著的為敵克松對TA98的回變率降為9.3%。整體來看,加熱對陽性物的誘導突變作用影響較大,所有陽性物加熱后回變率均降低,回變率降至50%以下的占60%。證明加熱對致突變物的影響顯著。從陽性物角度分析,受加熱影響較大的為敵克松、2-氨基芴、甲基磺酸甲酯;而二氨基蒽和1.8-二羥基蒽醌2種陽性物熱穩(wěn)定性更好。從代謝活化角度分析,需活化(甲基磺酸甲酯、2-氨基芴)和不需活化(敵克松)不受其影響,沒有明顯區(qū)別。3.2加熱對不同濃度混合陽性物的影響按2.3.2方法進行加熱對不同濃度混合陽性物的影響實驗,結果見表4。表4顯示,所有菌的溶劑對照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),推薦陽性物組的自發(fā)回變菌超過陽性物回變的最低值。加熱后所有濃度混合陽性物的回變率均降低,稀釋到4倍時,TA98加熱后不加S9組降低至43.4%。稀釋8倍時TA98不加S9回變率降低為46.1%,TA100加S9降低為49.1%。其余所有加熱過的混合陽性物較不加熱的回變率均降低,但降幅未超過50%。在實際情況中致畸物的污染很少會是單一物質,為了進一步研究加熱對致畸物的影響。參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范2003年版》采用推薦的4種陽性物用相應溶劑配制好后等體積混合,制作為模擬混合陽性物為研究對象,首先分析未加熱情況下變化,結果見表5。不考慮濃度變化和加熱,由表5可見混合陽性物原液較推薦陽性物對4個菌株的誘導效率均下降,其中TA100受影響最小。本實驗中將4種陽性物等體積混合后平板摻入量依然為100μL/皿(與推薦陽性物的摻入量相同),等體積混合后相當于原匹配的陽性物減少為25%;75%為菌種和活化狀態(tài)非針對性陽性物質。而Ames試驗規(guī)范推薦的陽性物劑量、針對的菌種和活化狀態(tài)均是經(jīng)過專門篩選優(yōu)化的,因此誘導效率下降是符合規(guī)律的。而TA100受影響小證明其較其他菌株對陽性物的選擇性沒有專一性。進一步分析濃度和加熱的相互影響,結果見圖1。結果顯示:加熱和不加熱2種情況下4個菌株隨混合陽性物濃度變化的趨勢顯著(圖1a);即無論加熱還是不加熱,TA98的回變濃度曲線斜率是最大的,可見TA98對混合陽性物的濃度變化非常敏感,而其他3個菌受濃度影響較小。而圖1b表明經(jīng)過加熱后所有濃度混合陽性物對所有菌的回變數(shù)值均降低,與推薦陽性物結果一致。但以降低至50%以下為標準時,混合陽性物原液為0組,稀釋2倍為0組,稀釋4倍為1組,稀釋8倍為2組。加熱對結果的影響隨濃度降低而增加。從單個菌角度分析回變率與混合陽性物濃度呈正相關,不管加熱不加熱、加S9和不加S9,所有的回變率都隨濃度降低而降低,同時具有良好的梯度關系。3.3加熱對不同濃度混合陽性物的誘導效率為進一步模擬實際情況,在混合陽性物基礎上制備模擬污染的保健食品為研究對象。選取1種以中藥顆粒為主要組分的保健食品“瑪咖片”作為基質,參照2003年版《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》將其配制為0.05g/mL水溶液作為基質。按表2配制混合陽性物到瑪咖片溶液中,最終保證混合陽性物的濃度與2.3.1的混合陽性物完全相同,試驗組設置與2.3.2相同。結果見表6。由表6可知:所有菌的溶劑對照回變率均在自發(fā)回變范圍內(nèi),推薦陽性物組的自發(fā)回變菌超過陽性物回變的最低值。加熱后所有濃度混合陽性物的回變率均降低?；旌详栃晕镌杭訜岷?TA97、TA98、TA100、TA102不加S9及TA102加S9回變率均降低至50%以下;稀釋2倍組加熱后:TA97、TA98、TA100不加S9回變率均降低至50%以下;稀釋4倍組加熱后,TA97、TA98不加S9回變率均降低至50%以下。進一步對比未加熱的混合陽性物原液與推薦陽性物回變率,結果見表7。表7結果顯示:不考慮濃度變化和加熱,混合陽性物原液較推薦陽性物對4個菌株的誘導效率均下降。與無基質的結果主要差異在于TA102受影響最小。進一步分析濃度和加熱的相互影響,結果見圖2。結果顯示:加熱和不加2種情況下4個菌株隨混合陽性物濃度變化的趨勢顯著(圖2a);即與無基質情況不完全相同,TA98加熱組的加S9隨濃度變化曲線依然陡峭,其他各組卻趨于平緩。而圖2b表明在基質中與前面推薦陽性物及混合陽性物的結果一致,經(jīng)過加熱后所有濃度混合陽性物對所有菌的回變數(shù)值均降低。但以降低至50%以下為標準時,趨勢有所變化?；旌详栃晕镌河?組降至50%以下,稀釋2倍為3組,稀釋4倍為2組,稀釋8倍為0組。與無基質的結果相反,加熱對結果的影響隨濃度降低而減少。與無基質情況相同,從單個菌角度來看,回變率與混合陽性物濃度是呈正相關的,不管加熱不加熱、加S9和不加S9所有的回變率都隨濃度降低而降低,同時也具有良好的梯度關系。4加熱對不同陽性物的影響目前未見針對保健食品中致畸物(致癌物)污染情況的相關調查研究。考慮到保健食品原料主要為中藥材及可食用的天然植物食品原料,污染應主要來自中草藥及天然植物原料種植時的土壤及水體污染,因此農(nóng)殘和環(huán)境污染應為重點來源。我國中藥材農(nóng)殘問題近年呈上升趨勢,2013年綠色和平組織發(fā)布的《藥中藥:中藥材農(nóng)藥污染調查報告》中,對包括德國、法國、荷蘭、加拿大、美國、意大利、英國在內(nèi)的7個國家市場上產(chǎn)自中國的菊花、枸杞、金銀花等常用中藥材進行了抽樣檢測,結果發(fā)現(xiàn),90%的樣品中被檢測出農(nóng)殘最終本研究選定Ames推薦陽性物作為研究對象。推薦陽性物中的敵克松是1958年由西德拜耳公司首先開發(fā)的產(chǎn)品,作為一種農(nóng)藥主要用于蔬菜病害的防治,呈紅棕色、油狀,其BOD/COD<0.19,很難降解本研究發(fā)現(xiàn):基于Ames試驗平板摻入法,3組實驗結果均清楚地表明加熱對陽性物誘變物的活力是有明顯影響的。但這種影響在水或中藥材顆粒基質中并不完全相同。水溶液體系中,推薦陽性物方案受加熱影響誘導效率降至50%以下的占60%。當單一陽性物換為復雜混合陽性物時,誘導效率較標準推薦方案會大大下降,且在保健食品基質和水中的變化也有差異。其可能是中藥顆粒對陽性物有吸附作用,其釋放速遞或與菌株的接觸面積發(fā)生了改變導致。而濃度也是一個重要因素,在不同基質中混合陽性物表現(xiàn)出的誘導效率變化規(guī)律差異較大。水溶液中混合陽性物隨濃度降低受加熱的影響有增大趨勢,但總的來講影響較小,僅占所有考察情況的4種菌、4個濃度、加和不加S9共32種情況的(3/32)9.375%。而在以瑪咖片為基質時(瑪咖粉50%,山梨糖醇34.2%,牡蠣提取物9%、其他為賦形劑和添加劑)