大黃素型單酮遺傳毒性致基因突變的體外pig-a和miniames試驗(yàn)研究

大黃素型單酮遺傳毒性致基因突變的體外pig-a和miniames試驗(yàn)研究

茴香素含量很高，通常用于何首烏、人參等藥物，隨著藥物儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，其安全性受到廣泛關(guān)注。不同蒽酮類(lèi)化合物可在體內(nèi)經(jīng)不同代謝通路相互轉(zhuǎn)化。課題組前期研究顯示，二蒽酮及蒽酮糖苷類(lèi)成分對(duì)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(bilirubinuridinediphosphateglucuronosyltransferase1A1,UGT1A1）有抑制作用，且空間暴露程度不同對(duì)其與UGT1A1酶的結(jié)合存在一定影響，導(dǎo)致不同程度肝毒性大黃素型單蒽酮化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖1）?；跀?shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)報(bào)道的化合物毒性預(yù)測(cè)軟件DerekNexus(Version6.0.1、LhasaLimited,UK）未能檢索到其含有導(dǎo)致細(xì)菌突變的毒性警示結(jié)構(gòu)，然而基于構(gòu)效關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析的化合物毒性預(yù)測(cè)軟件SarahNexus(Version6.0.1、LhasaLimited,UK）則根據(jù)其含有的蒽環(huán)結(jié)構(gòu)判斷在體外試驗(yàn)系統(tǒng)中致突變性陽(yáng)性的可能性為30%。本研究首次使用經(jīng)典的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）和新興的基于體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)，兩種針對(duì)堿基突變風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)方法，對(duì)單蒽酮的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)作初步評(píng)價(jià)，為單蒽酮在藥材中的定量、合理用藥、有效監(jiān)管提供參考。1材料表面1.1蘑菇和細(xì)胞本研究使用菌株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（his小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Ytk1.2試劑和機(jī)器1.2.1抑制劑的合成及功能性狀主要包括大黃素型單蒽酮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所楊建波博士贈(zèng)送，純度≥95%）；陰性對(duì)照二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）、陽(yáng)性對(duì)照2-(2-呋喃基）-3-(5-硝基-2-呋喃基）丙烯酰胺（2-2-Furyl-3-5-Nitro-2-Furylacrylamide,AF-2,Sigma）、2-氨基蒽（2-Aminoanthracene,2-AA）、葡萄糖-6-磷酸（Glucose6-phosphate,G-6-P），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉（NADPNa1.2.2熒光顯微鏡ix71,ofici流式細(xì)胞儀（FACSCalibur,BDbioscience）；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge5810R,Eppendorf）；倒置熒光顯微鏡（IX71,Olympu）；二氧化碳培養(yǎng)箱（HERAcellVIOS160i,ThermoFisher）；生物安全柜（NU-543-400S,Nuair）；恒溫培養(yǎng)箱（MIR-253，三洋）；倒置顯微鏡（CKX31,Nikon）；免疫磁性分離架（QuadroMACSTMSeparator,Miltenyi）。2方法2.1細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)試驗(yàn)流程，底層瓊脂、磷酸鹽緩沖液、SEM頂層瓊脂及S2.2試驗(yàn)用濃度的確定預(yù)試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行摸索，研究顯示當(dāng)單蒽酮濃度大于1.56μg/mL或作用時(shí)間大于4h時(shí)都呈現(xiàn)出較大的細(xì)胞毒性，出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，故最終確定試驗(yàn)用濃度為（0.2μg/mL,0.39μg/mL,0.78μg/mL,1.56μg/mL），作用時(shí)間4h。將L5178Y細(xì)胞解凍復(fù)蘇后置于完全培養(yǎng)基R10（含有10%馬血清，1%青鏈霉素混合液，0.2mg/mL丙酮酸鈉的RPMI1640）在37℃、5%CO非SS2.3pig-a突變檢測(cè)取2×102.4處理數(shù)據(jù)2.4.1計(jì)算均值，標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)數(shù)每孔中的回復(fù)菌落數(shù)量，每個(gè)濃度組分別求得均值，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)試驗(yàn)組平均每孔中的回復(fù)菌落數(shù)≥溶媒對(duì)照組數(shù)值2～3倍，且存在量效關(guān)系時(shí)判斷結(jié)果為陽(yáng)性；反之為陰性。2.4.2數(shù)據(jù)處理組間突變率比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphpadPrism7(USA,GraphPadSoftware公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用OneWayANOVA檢驗(yàn)將各受試物處理組的突變率與溶媒對(duì)照組作比較，組間比較P<0.05視為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)試驗(yàn)使用6種不同鼠傷寒沙門(mén)氏菌及1種大腸埃希氏菌開(kāi)展基于6孔板培養(yǎng)的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，評(píng)價(jià)單蒽酮誘導(dǎo)細(xì)菌堿基突變風(fēng)險(xiǎn)。濃度為0.6～9μg/皿的單蒽酮在無(wú)及有S3.2皮g-a突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果3.2.1單環(huán)酮活性物質(zhì)單蒽酮給藥4h(-S4體腸灌流模型及篩選大黃素型單蒽酮母核結(jié)構(gòu)與蒽醌結(jié)構(gòu)相似，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationaAgencyforResearchonCancer,IARC）于2017年10月27日公布的致癌物清單初步整理參考，蒽醌在2B類(lèi)致癌物清單中。提示蒽醌類(lèi)結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的致癌風(fēng)險(xiǎn)，而蒽醌結(jié)構(gòu)可在酸性環(huán)境中被還原，生成蒽酚及其互變異構(gòu)體蒽酮。有研究報(bào)道采用體腸灌流模型Ames試驗(yàn)作為遺傳毒性數(shù)據(jù)庫(kù)（如Derek,Sarah）構(gòu)建的基礎(chǔ)以及新藥研發(fā)初期先導(dǎo)化合物篩選的首選遺傳毒性評(píng)價(jià)方法，是基于細(xì)菌體系評(píng)價(jià)物質(zhì)致基因突變的最重要的試驗(yàn)方法之一，在藥品、食品、化妝品、醫(yī)療器械等物質(zhì)遺傳毒性評(píng)價(jià)中均是組合必選試驗(yàn)之一。miniAmes是在標(biāo)準(zhǔn)平板基礎(chǔ)上采用6孔板或24孔板代替10cm本研究在miniAmes試驗(yàn)前提下，開(kāi)展體外Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)作為大黃素型單蒽酮體外遺傳毒性評(píng)價(jià)的后續(xù)追蹤試驗(yàn)，對(duì)Pig-a基因突變位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)綜上，本研究從Ames和體外哺乳動(dòng)物小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y細(xì)胞開(kāi)展大黃素型單蒽酮基因突變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，提示大