免疫學實驗技術(shù)專家講座

抗體定義：指機體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成漿細胞所產(chǎn)生、可與抗原發(fā)生特異性結(jié)合免疫球蛋白。醫(yī)學應用：科研應用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀、免疫熒光技術(shù)、ELISA等1.診療：各類血清學檢測，抗人球蛋白測試，早孕檢測等2.治療：單克隆抗體療法（類風濕性關(guān)節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療。免疫學實驗技術(shù)專家講座第1頁多抗起源動物脾臟有上百萬種不一樣B淋巴細胞系，含有不一樣基因不一樣B淋巴細胞合成不一樣抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上許多決定簇分別激活各個含有不一樣基因B細胞。被激活B細胞分裂增殖形成效應B細胞（漿細胞）和記憶B細胞，大量漿細胞克隆合成和分泌大量抗體分子分布到血液、體液中，即為多克隆抗體。免疫學實驗技術(shù)專家講座第2頁多克隆抗體制備動物選擇：兔子（rabbit）：最慣用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量極少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：慣用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。馬（horse）：慣用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國外試驗室慣用。免疫學實驗技術(shù)專家講座第3頁基本步驟延長抗原作用時間增強吞噬作用刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”佐劑作用機理：抗原制備：商品化或自行表示基礎(chǔ)免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（ComplateFreund’adjuvand,含礦物油,卡介苗等)。加強免疫：第2次以后，抗原量減半，屢次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).取血測效價：加強免疫兩次或三次以后第7天取血。放血制備血清：可一次放血(頸動脈)也可屢次取血(耳靜脈)免疫學實驗技術(shù)專家講座第4頁試驗方法新西蘭大耳白，g(雌雄均可),健康,無病原基礎(chǔ)免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108顆?？乖?0.5ml佛式完全佐劑(CFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射加強免疫間隔2-4周,可進行屢次0.5ml抗原(蛋白量減半)0.5ml佛式不完全佐劑(IFA)制備抗原-佐劑乳化液背部、頸部皮下多點注射或腿部肌肉注射免疫學實驗技術(shù)專家講座第5頁試驗方法免疫3~4次以后從耳靜脈取血檢測效價酶聯(lián)法：1:104以上，能到達1:106。免疫雙擴散：1:16以上，能到達1:64效價到達要求可放血制備血清可一次放血(頸動脈)也可屢次取血(耳靜脈)免疫學實驗技術(shù)專家講座第6頁多抗特點多抗是單抗混合物，所以多抗性質(zhì)是一個群體綜合性質(zhì)。比單抗更輕易捕捉抗原。因為含有抗不一樣表位抗體，各種抗體都可與抗原結(jié)合。特異性相對較差：因為由不一樣性質(zhì)抗體組成，只要其中含交叉反應抗體，多抗就有交叉反應，所以多抗更輕易有交叉反應。抗體純化、標識比單抗難：因為含有各種不一樣類型、亞類抗體，提純、標識方法有所差異。同時,血清中含有雜蛋白比較多。免疫學實驗技術(shù)專家講座第7頁什么情況下需要制備單克隆抗體目標蛋白有結(jié)構(gòu)類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診療，研制成診療試劑免疫學實驗技術(shù)專家講座第8頁單抗制備原理假如能選出一個制造一個專一抗體漿細胞進行培養(yǎng)，就可得到由單細胞經(jīng)分裂增殖而形成細胞群，即單克隆。單克隆細胞將合成針對一個抗原決定簇抗體，稱為單克隆抗體。1975年分子生物學家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖小鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)抗原免疫后純系小鼠脾細胞融合，成為雜交細胞系，既含有瘤細胞易于在體外無限增殖特征，又含有抗體形成細胞合成和分泌特異性抗體特點。將這種雜交瘤作單個細胞培養(yǎng)，可形成單細胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種方法，便能得到大量、高濃度、非常均一抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸次序、特異性等都是一致，而且在培養(yǎng)過程中，只要沒有變異，不一樣時間所分泌抗體都能保持一樣結(jié)構(gòu)與機能。免疫學實驗技術(shù)專家講座第9頁單抗制備原理HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黃嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)免疫學實驗技術(shù)專家講座第10頁基本步驟免疫學實驗技術(shù)專家講座第11頁試驗方法免疫小鼠選擇體重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制備抗原免疫。50—100ug抗原/只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合。細胞融合取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）按5-10：1百分比，在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50%PEG（Sigma）作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有喂養(yǎng)細胞細胞板中，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。免疫學實驗技術(shù)專家講座第12頁陽性細胞篩選細胞培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10%-50%時，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔。陽性孔特異性判定采取間接ELISA方法，用包被液稀釋成1－10ug/mL抗原100ul/孔包被ELISA板，4℃過夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1－10％脫脂奶粉或1－3％BSA或3－6％牛血清封閉30-60min;加入陽性孔培養(yǎng)上清100ul/孔，37℃1－2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍辣根過氧化物酶標識兔抗鼠IgG二抗（Sigma企業(yè)）100ul/孔，37℃1－2小時，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/LH2SO4終止反應后，用酶標儀讀取OD492值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽性。獲分別對上述抗原有特異性反應陽性孔。篩選出特異性陽性孔用常規(guī)有限稀釋法克隆，獲對上述抗原有特異性反應雜交瘤細胞株。細胞株深入擴大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。免疫學實驗技術(shù)專家講座第13頁雜交瘤細胞凍存雜交瘤細胞通慣用含有8％--10%二甲亞砜和20％小牛血清培養(yǎng)基凍存于液氮中，在液氮中細胞能夠保留多年，在-80℃中能夠作3-6個月短期保留。凍存細胞需要遲緩降溫，復蘇細胞時需快速升溫，這么能夠確保細胞有較高存活率。免疫學實驗技術(shù)專家講座第14頁單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×105個雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部顯著膨大，采取腹水，rpm離心3min，搜集上清液，即為單克隆抗體腹水。辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體：取1倍體積腹水加2倍體積0.06MPH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸（30ul/ml腹水），室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時，1rpm離心20min，搜集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積PBS溶液溶解，在4℃流動透析24小時后即獲純化腹水抗體，-70℃保留。免疫學實驗技術(shù)專家講座第15頁其它抗體純化方法鹽析法（硫酸銨沉淀)離子交換法親和層析法凝膠過濾法免疫學實驗技術(shù)專家講座第16頁鹽析法（硫酸銨沉淀)原理在高濃度中性鹽存在下,蛋白質(zhì)在水中溶解度降低而產(chǎn)生沉淀硫酸銨是最慣用中性鹽不一樣蛋白質(zhì)鹽析常數(shù)不一樣硫酸銨加入量通常以飽和度表示(100%飽和度:767g/L)特點成本低，步驟簡單?？贵w回收率比較高?？贵w純度比較低，電泳后可見到顯著雜帶,不適合于做各種標識。需要高速離心機。免疫學實驗技術(shù)專家講座第17頁正辛酸-硫酸銨沉淀法原理兩步沉淀：先加正辛酸去雜蛋白.正辛酸是一個有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子雜蛋白沉淀.后加硫酸銨使抗體沉淀.特點成本較低，步驟較復雜?？贵w回收率很低。抗體純度高，電泳后雜帶極少，適合于各種標識。需要高速離心機，耐高速離心玻璃離心管。免疫學實驗技術(shù)專家講座第18頁離子交換法原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)協(xié)力差異進行物質(zhì)分離.DEAE是一個陰離子交換劑，本身帶正電荷(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)將樣品pH值調(diào)至等電點以上,使樣品帶負電荷.采取鹽溶液洗脫,經(jīng)過高濃度帶同種電荷離子(Cl-)置換被分離組分.特點成本較低，步驟較簡單。抗體回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少許雜帶，適合于各種標識。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動搜集器。免疫學實驗技術(shù)專家講座第19頁親和層析法原理利用蛋白質(zhì)之間特異性結(jié)合（抗體-抗原，受體-配體）將一個配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配物質(zhì)。洗脫普通采取改變pH值方法特點成本較低，步驟較簡單?？贵w回收率較高?？贵w純度較高，電泳后可見少許雜帶，適合于各種標識。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動搜集器。免疫學實驗技術(shù)專家講座第20頁凝膠過濾法(分子篩)原理將樣品混合物經(jīng)過一定孔徑凝膠介質(zhì),因為流經(jīng)路徑差異,使不一樣分子質(zhì)量組分分離.大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外經(jīng)過，走得快；小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部再出來，走得慢。適合于IgM類抗體純化

(五聚體,分子量約800KD)特點成本高，步驟較簡單?？贵w回收率較高，分離條件緩解，抗體活性不受影響。抗體純度較高。需要自動搜集器。免疫學實驗技術(shù)專家講座第21頁純化方法選擇標準不需要純化則不純化；（詳細應用）依據(jù)后續(xù)試驗需求及試驗室條件。免疫學實驗技術(shù)專家講座第22頁腹水效價測定用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，腹水效價在10-5-10-7之間可用于實際應用。免疫學實驗技術(shù)專家講座第23頁單抗與多抗比較單抗多抗抗體組成單一復雜抗體性質(zhì)個體屬性群體綜合性質(zhì)純化標識輕易，效果好難度高一些種屬起源絕大多數(shù)是小鼠兔、羊、豚鼠等制備周期長(最短4個月）短（2個月）制備技術(shù)復雜簡單經(jīng)費多少免疫學實驗技術(shù)專家講座第24頁酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）蛋白免疫印跡（Westernblot）免疫熒光技術(shù)（IF）免疫共沉淀（Co-IP)染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch-IP)免疫學實驗技術(shù)專家講座第25頁ELISA基本原理酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）基礎(chǔ)是抗原或抗體固相化及抗原或抗體酶標識。結(jié)合在固相載體表面抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標識抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶活性。在測定時，受檢標本（測定其中抗體或抗原）與固相載體表面抗原或抗體起反應。用洗滌方法使固相載體上形成抗原抗體復合物與液體中其它物質(zhì)分開。再加入酶標識抗原或抗體，也經(jīng)過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上酶量與標本中受檢物質(zhì)量呈一定百分比。加入酶反應底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，故可依據(jù)呈色深淺進行定性或定量分析。免疫學實驗技術(shù)專家講座第26頁ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要試劑：（1）固相抗原或抗體，即“免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標識抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；（3）酶反應底物。可設(shè)計出各種不一樣類型檢測方法。免疫學實驗技術(shù)專家講座第27頁慣用ELISA方法1）直接ELISA：待測抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特異性酶-特異性抗體偶聯(lián)物。因為所用酶已經(jīng)標識在特定抗體上，可檢測病毒種類只能局限于某一個。2）間接ELISA：先用抗原包被微量滴定板，然后加入待測抗體，再加入酶標抗體。與直接ELISA相比，間接ELISA適用范圍更為廣泛，而且特異性也很好。3）夾心ELISA：使用俘獲抗體（包含單抗和多抗）包被微量滴定板，其余步驟同間接ELISA。依據(jù)包被抗體種類不一樣，又能夠分為同種單抗夾心ELISA，異種單抗夾心ELISA，各種單抗混合夾心ELISA和多抗夾心ELISA等幾個方法。與間接ELISA相比，夾心ELISA多了一步以抗體俘獲富集抗原過程，因而其靈敏度和特異性也對應提升。不過對有些病毒株系，夾心ELISA并不是很好選擇。這可能與單克隆抗體識別是蛋白亞基抗原表位還是病毒粒子表面抗原表位相關(guān)免疫學實驗技術(shù)專家講座第28頁基本步驟包被封閉孵育洗滌顯色結(jié)果測定免疫學實驗技術(shù)專家講座第29頁基本步驟包被：將抗原或抗體固定在固相載體上過程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合，靠是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上疏水基團與固相載體表面疏水基團間作用。這種物理吸附是非特異性，受蛋白質(zhì)分子量、等電點、濃度等影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被抗原經(jīng)固相抗體親和層析作用，包被在固相上抗原純度大大提升，所以含雜質(zhì)較多抗原也可采取捕捉包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化DNA，這種包被方法均勻、牢靠，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機溶劑（比如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點：試驗特異性、敏感性均由此得以改進，重復性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被1/10乃至于/100。免疫學實驗技術(shù)專家講座第30頁包被條件：

包被液：pH9.6碳酸鹽緩沖液、pH7.2磷酸鹽緩沖液、pH7-8Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物性質(zhì)可有很大改變，每批材料需經(jīng)過試驗與酶結(jié)合物濃度協(xié)調(diào)選定。普通蛋白質(zhì)包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。包被緩沖液選擇要依靠你所包被物質(zhì)而定，沒有絕正確選擇，但有一個標準就是要盡可能保持包被物活性不被損失。當前慣用包被緩沖液有PBS、CBS、tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，普通來說，緩沖液pH要大于蛋白質(zhì)pI，以保持其活性。堿性包被液如碳酸緩沖液用較多，尤其是在小分子和載體蛋白偶聯(lián)物包被，其主要優(yōu)勢在于堿性環(huán)境能夠使蛋白更輕易與板子結(jié)合。也有用PBS和檸檬酸緩，不過比較少見。免疫學實驗技術(shù)專家講座第31頁洗滌：ELSIA洗滌：到達分離游離和結(jié)合酶標識物目標。慣用洗滌液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，5min/次。去除殘留在板孔中游離物質(zhì)，以及非特異性地吸附干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)吸附是普遍性，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附干擾物質(zhì)洗滌下來。能夠說在ELISA操作中，洗滌是最主要關(guān)鍵技術(shù)。免疫學實驗技術(shù)專家講座第32頁封閉：封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被過程。封閉就是讓大量不相關(guān)蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止ELISA后續(xù)步驟中抗原或抗體與固相載體直接吸附。慣用封閉劑：0.05%-0.5%BSA;10%小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，能夠高濃度使用（5%）。全部ELISA固相均需封閉。孵育：抗原抗體完成反應保溫過程稱為孵育，通常37℃孵育0.5-1h。應注意孵育溫度和時間應按要求力爭準確。為確保這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。免疫學實驗技術(shù)專家講座第33頁顯色：于各反應孔加入暫時配制TMB底物溶液0.1ml，37℃反應10-30min。顯色是酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物溫育反應。反應溫度和時間仍是影響顯色原因。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間延長而呈色加強。適當提升溫度有利于加速顯色進行。結(jié)果測定：于各反應孔加入2M硫酸0.05ml，終止反應；拭干板底附著液體，然后將板正確放入酶標比色儀中。于450nm處，以空白孔調(diào)零后測定各孔OD值。免疫學實驗技術(shù)專家講座第34頁結(jié)果判定：目測定性法：加入底物經(jīng)酶解和終止反應后，肉眼觀察陽性孔顏色顯著深于(競爭法則淺于)陰性對照；與陰性對照顏色靠近者，判定為陰性。以P/N值(陽性孔OD值/陰性孔OD值)大于或等于2.1為陽性；P/N值小于2.1，但大于1.5為可疑；P/N小于1.5為陰性。

免疫學實驗技術(shù)專家講座第35頁對照設(shè)定陽性對照和陰性對照是檢驗試驗有效性控制品，同時也是作為判斷結(jié)果對照。陽性對照基本組成應盡可能與檢測標本組成一致，多以含蛋白保護劑緩沖液為基質(zhì)。陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。參考標準品：定量測定應含有制作標準曲線用參考標準品，應包含覆蓋可檢測范圍4-5個濃度。免疫學實驗技術(shù)專家講座第36頁ELISA應用ELISA應用范圍很廣，而且正在不停地擴大，標準上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，能夠直接定量測定體液中可溶性抗原。檢驗抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當，在血液學方面可用于檢驗凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細胞抗原及結(jié)合球蛋白（HaptoGlobin）等，在腫瘤方面已試用檢驗甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。檢驗抗體方面：用ELISA間接法檢驗抗體，已取得對各種傳染病和寄生蟲病血清學診療，亦開始廣泛用于現(xiàn)場流行病學調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診療；在免疫性疾病方面有試用作本身疫病抗體測定以及對過敏診療，比如檢測各種過敏原抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等；在衛(wèi)生學方面，可用于檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。免疫學實驗技術(shù)專家講座第37頁免疫印跡（westernblot）印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用對應探測反應來檢測樣品一個方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－DNA雜交檢測特定DNA片段方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后蛋白質(zhì)分子印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子印跡分析稱為Eastern印跡法。

埃德溫·邁勒·薩瑟恩（EdwinMellorSouthern）免疫學實驗技術(shù)專家講座第38頁基本原理免疫學實驗技術(shù)專家講座第39頁應用范圍檢測組織、細胞中蛋白表示情況（定性、半定量）免疫學實驗技術(shù)專家講座第40頁6.最終加上對應底物溶液，當二抗上酶催化底物產(chǎn)生化學發(fā)光時,用X光片曝光，洗片后就會產(chǎn)生可見區(qū)帶，指示目標蛋白質(zhì)位置和強弱。3.經(jīng)過電泳將蛋白樣品分開。5.印跡首先用封閉液（如5％脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩下疏水結(jié)合位點，而后用目標蛋白抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目標蛋白質(zhì)與一抗特異性結(jié)合。洗去游離一抗后，用再與酶標識二抗孵育4.將電泳分離蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一個固相支持體.轉(zhuǎn)移后硝酸纖維素膜就稱為一個印跡（blot），用于對蛋白質(zhì)深入檢測。1.提取細胞或組織蛋白，測定總蛋白濃度2.測定總蛋白濃度，并處理樣品基本步驟免疫學實驗技術(shù)專家講座第41頁細胞總蛋白提取提取細胞蛋白多是利用將細胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放原理。提取蛋白質(zhì)方法很多，鑒于后續(xù)試驗對蛋白性質(zhì)要求不一樣，所以極難找到一個萬能裂解方法。不論采取那種方法，都應遵照以下標準：1．盡可能采取簡單方法進行樣品處理，以防止蛋白丟失。2．細胞和組織樣品制備應盡可能降低蛋白降解，低溫和蛋白酶抑制劑能夠降低蛋白降解，蛋白酶抑制劑種類很多，要依據(jù)詳細情況詳細選擇。本試驗中選取PMSF(苯甲基磺酰氟)作為蛋白酶抑制劑。3．樣品裂解液應該新鮮制備，而且分裝凍存于-80℃。切勿重復凍融已制備好樣品。B．RIPAbuffer：Tris-HCl50mM,pH7.4NP-401%去氧膽酸鈉0.25%NaCl150mMEDTA1mM目標：要取得高豐度、高品質(zhì)蛋白質(zhì)，以滿足后續(xù)試驗需求A．細胞總蛋白裂解緩沖液(100ml)：1×PBS80mlTritonx-1001ml去氧膽酸鈉0.5gSDS0.1g補1×PBS緩沖液至100ml.免疫學實驗技術(shù)專家講座第42頁注意事項：1.注意個人防護。PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，馬上用大量水沖洗。2.所用離心機需提前預冷。3.為預防蛋白降解，全部操作應在冰上完成。4.吸收蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。免疫學實驗技術(shù)專家講座第43頁WesternBlot作為一項半定量試驗技術(shù)，電泳前，必須盡可能使各組之間總蛋白量基本一致;蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對目標蛋白判定;蛋白質(zhì)含量太高則會使帶形扭曲,甚至會影響此電泳方法分辨力基于以上兩方面原因，在進行蛋白電泳之前，先要對提取總蛋白進行含量測定蛋白定量免疫學實驗技術(shù)專家講座第44頁當前慣用有五種經(jīng)典方法，即定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法即使比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定蛋白質(zhì)作為其它方法標準蛋白質(zhì)。值得注意是，這后四種方法并不能在任何條件下適合用于任何形式蛋白質(zhì)，因為一個蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不一樣結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺，都有其優(yōu)缺點。

蛋白定量方法免疫學實驗技術(shù)專家講座第45頁SDS電泳SDS是一個離子性表面活性劑,它有強離子性硫酸根離子也帶有疏水性長碳鏈。當SDS與蛋白質(zhì)混合時，它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以磺酸根離子外露與水分子作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定百分比SDS后，因為SDS帶強負電荷，使蛋白質(zhì)原先所帶電荷顯得微不足道,且每單位重量蛋白質(zhì)所帶電荷一致，所以不一樣蛋白質(zhì)遷移率大小就主要由蛋白分子大小這一主要原因決定。免疫學實驗技術(shù)專家講座第46頁SDS聚丙烯酰胺凝膠有效分離范圍取決于灌膠聚丙烯酰胺濃度和交聯(lián)度ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝膠有效分離范圍丙烯酰胺濃度(%)線性分離范圍／KDa1510-431212-601020-807.536-945.057-212免疫學實驗技術(shù)專家講座第47頁1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前含有很強神經(jīng)毒性

并輕易吸附于皮膚，其作用含有累積性，故稱量或配膠時應戴手套及口罩2.過硫酸銨會遲緩分解，應隔周新鮮配制3.溶液中一旦加入TEMED，應馬上混勻并快速灌注入玻璃夾槽中4.為保持電泳平衡，在無樣品孔中也應加入適量4×蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液5.正確連接電泳連線（負極在上，正極在下）以確保蛋白由上向下方向電泳6.電泳盡可能在4℃冰箱中進行注意事項：免疫學實驗技術(shù)專家講座第48頁轉(zhuǎn)膜凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離蛋白條帶經(jīng)過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，慣用固相支持物有NC（硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。選擇膜主要依據(jù)有：1.膜與目標蛋白分子結(jié)合能力（也就是單位面積膜能結(jié)合蛋白載量）2.膜孔徑（也就是攔截蛋白大小）3.不影響后續(xù)顯色檢測（也就是適適用于所選顯色方法，信噪比好）4.假如后繼試驗有其它要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要依據(jù)不一樣目標來挑選不一樣轉(zhuǎn)移膜免疫學實驗技術(shù)專家講座第49頁免疫學實驗技術(shù)專家講座第50頁-濾紙凝膠膜濾紙+免疫學實驗技術(shù)專家講座第51頁1.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用2.檢驗樣品凝膠是否與轉(zhuǎn)移槽“-”側(cè)保持一致，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。3.NC膜應小心操作，預防破裂注意事項：免疫學實驗技術(shù)專家講座第52頁轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應，利用ECL（增強化學發(fā)光）發(fā)光或DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測目標蛋白。ECL試劑采取氧化還原反應原理：利用二抗上標識辣根過氧化物酶(HRP)，使底物發(fā)生氧化還原反應，從而產(chǎn)生化學。固相免疫檢測免疫學實驗技術(shù)專家講座第53頁DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物，從而指示目標蛋白位置及強弱。ECL發(fā)光相對于DAB顯色而言，含有發(fā)光持久，靈敏度高(普通可到達pg級以上)等優(yōu)點，且DAB含有致癌性。應用化學發(fā)光，膜能夠再生檢測其它蛋白。免疫學實驗技術(shù)專家講座第54頁1.處理膜過程中，切勿使膜干掉（不然造成背景增高）2.選擇適當一抗及二抗?jié)舛龋舛雀卟灰欢ㄐЧ茫^高會造成背景變黑）3.選擇適當封閉液（假如膜需要再生，最好選取脫脂奶粉，而非BSA）4.應考慮ＥＣＬ試劑發(fā)光強度及其衰滅時間，來選擇適當曝光時間注意事項：免疫學實驗技術(shù)專家講座第55頁一、膜上沒有信號

答：原因有很多：1細胞中不表示這種蛋白質(zhì)，換一個細胞；2細胞中蛋白質(zhì)被降解掉了，必需加入PMSF或其它蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，而且提取過程冰上操作；3轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；4抗體或酶失活，選擇在使用期內(nèi)試劑；5抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看該抗體是否適合用于western。結(jié)果分析免疫學實驗技術(shù)專家講座第56頁二、目標帶很弱

答：1標本中靶蛋白含量低，能夠加大樣品上樣量。2轉(zhuǎn)膜不充分，能夠經(jīng)過提升轉(zhuǎn)膜電流或延長轉(zhuǎn)膜時間來處理。3抗體效價低，能夠降低抗體稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度。三、膠片背景很臟，有什么處理方法？答：1膜沒有均勻浸濕，PVDF膜轉(zhuǎn)膜前應該用100%甲醇將膜完全浸濕10秒，快速激活；2膜或者緩沖液污染，拿取膜與吸水紙時要戴手套，及時更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液；3封閉不充分，延長封閉時間；4抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應，檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應，假如有，考慮更換封閉液；5抗體濃度過高，增加抗體稀釋倍數(shù)免疫學實驗技術(shù)專家講座第57頁四、條帶中出現(xiàn)單個或多個白點？答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時趕盡膜和膠塊之間氣泡五、制備凝膠不平？答：膠板洗刷潔凈，加入試劑后搖勻，使其充分混合，預防部分膠塊聚合不均勻，溫度適當，受熱不均勻造成膠聚合不均勻，室溫較高時，操作應快速。免疫學實驗技術(shù)專家講座第58頁六、用于western抗體和用于ELISA抗體有什么不一樣要求？答：普通來說用于western抗體識別是氨基酸序列特異性；而用于ELISA抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以普通依據(jù)抗體說明書來確定。七、檢測到抗原分子量是資料上兩倍，是怎么回事？

答：抗原形成了二聚體。增多β-巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，能夠打開二聚體。免疫學實驗技術(shù)專家講座第59頁八、做western必須要內(nèi)參嗎？答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量主要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致情況下，目標蛋白條帶出現(xiàn)差異才有意義,表明確實是試驗設(shè)計干預原因造成目標蛋白量改變，而不是加樣誤差造成目標條帶含量改變.所以內(nèi)參是必須做。MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY,May,p.3563–3574免疫學實驗技術(shù)專家講座第60頁內(nèi)參即是內(nèi)部參考，對于哺乳動物細胞表示來說普通是指由管家基因編碼表示蛋白，它們在各組織和細胞中表示相對恒定，普通要選擇一個在處理原因作用條件下蛋白含量不會發(fā)生改變蛋白作內(nèi)參。內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍Tubulin55kD胞漿和全細胞VCDA1/Porin31kD線粒體COXIV16kD線粒體LaminB166kD細胞核TBP38kD細胞核免疫學實驗技術(shù)專家講座第61頁八、非特異條帶多答：1抗體特異性不夠，考慮使用單抗，確?？贵w特異性；2蛋白降解，應盡可能使用新鮮制備樣品，提取后一定要分裝，防止重復凍融。九、曝光后出現(xiàn)反像答：HRP含量過高造成，提議降低二抗使用濃度免疫學實驗技術(shù)專家講座第62頁免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence，IF）定義：將免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標識技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布方法。

原理：依據(jù)抗原抗體反應原理，先將已知抗原或抗體標識上熒光素制成熒光標識物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢驗細胞或組織內(nèi)對應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮熒光，能夠看見熒光所在細胞或組織，從而確定抗原或抗體性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫學實驗技術(shù)專家講座第63頁3T3LinePtK1LineNBL-6LineRK13LineLongitudinalFissureBloodVesselsCerebellum定位免疫學實驗技術(shù)專家講座第64頁直接法：熒光素標識特異性抗體直接與對應抗原反應。間接法：特異性抗體與對應抗原反應，熒光素標識抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

分類免疫學實驗技術(shù)專家講座第65頁試驗方法將培養(yǎng)好貼壁細胞用PBS輕輕漂洗2次(PBS提前置室溫)，防止細胞脫落；4%多聚甲醛室溫固定30min(靜置)；PBS涮洗3次，然后搖床遲緩搖洗5min×3次；0.5%Triton-100室溫遲緩搖30min，涮洗3次；用與二抗同源血清（10%），室溫遲緩搖擺封閉1h，置濕盒內(nèi)；用燒杯裝PBS，涮洗玻片一次；用紙將PBS吸干后，滴加一抗（約100ul），4度過夜，置濕盒中。鼠抗LRP16（1：100），兔抗p65（1：150）；PBS涮洗３次，搖床搖洗10min×３次；用紙將PBS洗干后，滴加二抗（羊抗鼠FITC[1：200］，羊抗兔594［1：600］）,濕盒，避光！室溫２h，加二抗以后全部操作均應避光；DAPI染核７min（用PBS按1：2500稀釋）；PBS涮洗３次，搖床慢速搖洗10min×３次；封片：甘油－PBS（1：1），每張片子約需13ul；共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果或-20度保留。免