高效液相色譜法測定一點(diǎn)紅中克氏千里光堿的含量

高效液相色譜法測定一點(diǎn)紅中克氏千里光堿的含量

又名紅景天、羊蹄草、紅葉草、紅葉草、紅葉果、青石等。這是科舉植物的紅色一點(diǎn)紅（l.）d的干燥草地。一點(diǎn)紅是我國南方地區(qū)習(xí)用的傳統(tǒng)中草藥,具有清熱解毒、散瘀消腫的功效,是婦科用中成藥花紅片、花紅膠囊的主要原料藥,臨床上常用于上呼吸道感染、口腔潰瘍、肺炎、泌尿道感染、乳腺炎、腸炎、外傷感染、急性結(jié)膜炎、急性扁桃體炎,膽囊炎、瘡疔癰腫、濕疹、跌打損傷等1點(diǎn)紅藥材Agilent1260高效液相色譜儀,KQ5200超聲儀,Satorius分析天平。一點(diǎn)紅藥材(市售)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所祝晨蔯研究員鑒定為菊科植物一點(diǎn)紅Emiliasonchifolia(L.)DC的干燥全草;克氏千里光堿對照品為實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)色譜法檢測其純度達(dá)到98%以上;乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。1.2在鉻條件下和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中色譜柱為KromasilRP-C1.3對照溶液的制備取干燥至恒重的克氏千里光堿對照品約10mg,精密稱定,加甲醇并制成每1mL含10mg的溶液,即得。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取對照品溶液0.1,0.2,0.3,0.5,0.8,1.0,2mL,置10mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,搖勻,分別吸取10μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以克氏千里光堿面積為縱坐標(biāo)(Y)、濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=58.767X-217.55(r=0.9998)。結(jié)果表明克氏千里光堿在10.04~200.8μg·mL1.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以克氏千里光堿含量為指標(biāo),在單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取甲醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平,選用L由正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析可知,各因素對克氏千里光堿提取量的影響程度大小依次為B>A>C,較優(yōu)水平組合為A1.6超聲處理法取供試品粗粉(過四號篩)1.0g,精密稱定,置50mL錐形瓶中,精密加入80%甲醇30mL,稱定重量,超聲處理(200W,40kHz)40min,放冷,稱重,用80%甲醇補(bǔ)足減失重量,搖勻,濾過,濾液濃縮至干,再用80%甲醇溶解定容至5mL量瓶中,搖勻,,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,取續(xù)濾液,即得。2結(jié)果與分析2.1重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)2.1.1精密度試驗(yàn)取“1.4”項(xiàng)下同一濃度的克氏千里光堿對照品溶液,依法連續(xù)測定6次,結(jié)果顯示峰面積的RSD為1.71%,表明儀器進(jìn)樣精密度良好。2.1.2重復(fù)性試驗(yàn)取同一批供試品粗粉1.0g,共6份,精密稱定,照“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依法測定克氏千里光堿含量,結(jié)果顯示其RSD為1.97%,說明方法重復(fù)性較好。2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液于0,2,4,8,12,24h進(jìn)行測定,結(jié)果顯示峰面積的RSD為1.31%,說明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.1.4加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的同一批供試品粗粉(過四號篩)0.5g,共6份,精密稱定,按低、中、高3個(gè)濃度分別精密加入克氏千里光堿對照品溶液(1.004mg·mL2.2樣品測定按建立的方法,對不同產(chǎn)地13批市售樣品進(jìn)行含量測定,結(jié)果見表4。3討論3.1測定成分的結(jié)構(gòu)試驗(yàn)克氏千里光堿對照品為本實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)3.2超聲提取法試驗(yàn)考察了回流法、超聲提取法兩種方法對克氏千里光堿含量測定的影響,結(jié)果表明,超聲法提取率較高,故選用超聲提取法;提取溶劑考察了三氯甲烷、甲醇和水三種不同提取溶媒,結(jié)果以甲醇提取更完全;考察了在溶媒中分別加入氨水和鹽酸,結(jié)果顯示提取率沒有明顯差異,故溶媒中無需加入氨水或鹽酸。利用正交試驗(yàn)確定供試品最佳提取工藝為加30倍80%甲醇超聲提取40min。3.3檢測波長的確定取“1.3”項(xiàng)下的對照品溶液,用DAD檢測器對克氏千里光堿進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果顯示克氏千里光堿在220nm處有最大吸收,故選擇220nm作為檢測波長。3.4洗脫系統(tǒng)溶劑試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸0.2%三乙胺溶液、乙腈-0.1%磷酸-0.4%三乙胺溶液4個(gè)溶劑洗脫系統(tǒng)。結(jié)果表明,以乙腈-0.1%磷酸-0.4%三乙胺溶液(pH=2.0)為流動相,色譜峰峰形尖銳對稱,分離度高,且基線穩(wěn)定,故選用乙腈0.1%磷酸-0.4%三乙胺溶液為流動相系統(tǒng)。4中藥成分檢測一點(diǎn)紅化學(xué)成分研究表明,克氏千里光堿是該植物的特征性成分之一,它是一種吡咯里西啶類生物堿,PAs是一類分布廣泛的植物性毒素,存在于許多中草藥中,一些品種還被歷版《中國藥典》所收載,例如2010年版《中國藥典》收載的“千里光”項(xiàng)下規(guī)定藥材中不得含有阿多尼弗林堿或其含量不得超過0.004%,對于藥材中有毒成分的檢測和規(guī)定其限量,可降低可能的