擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病機(jī)制及治療

擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病機(jī)制及治療

擴(kuò)張性心肌?。╰cm）是核電站心肌病，其主要特征是心臟收縮障礙和左心室擴(kuò)張。發(fā)病率高，患者可能心力衰竭。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小RNA并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá),研究顯示miRNA可調(diào)控T淋巴細(xì)胞發(fā)育及分化等過程1材料和方法材料表面共同語(yǔ)言患者的一般數(shù)據(jù)收集2015年3月至2016年4月本院收治的45例DCM患者為研究對(duì)象,作為DCM組,所有患者均符合WHO原發(fā)性擴(kuò)張性心肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)試劑和檢測(cè)試劑人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞JurkatT購(gòu)自武漢華連科生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自杭州仟諾生科技有限公司;雙熒光報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司;雙熒光報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京白奧萊博科技有限公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;anti-CD3、anti-CD28、anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PE抗體、anti-CD69-PE-Cy7抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;白細(xì)胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BDBio-sciences公司;MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;miR-33bmimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)及其陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司;MycsiRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol試劑與SYBRGreenqPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;M-MLVReverseTranscriptionKit試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;兔抗人Myc多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)有限公司;Westernblot所需試劑購(gòu)自上海西寶生物科技股份有限公司;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)MPBiomedicals公司;紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。方法分離人外周血細(xì)胞,制備pbmcs細(xì)胞采用肝素鈉抗凝試管收集兩者受試者外周靜脈血5ml,2500r/min離心8min,收集上層血漿,加入等體積無菌PBS緩沖液,另取10ml無菌離心管,加入等體積淋巴細(xì)胞分離液,緩慢加入外周血,離心機(jī)中2500r/min離心20min,取出中間PBMCs層,加入4mlPBS緩沖液,混勻,1600r/min離心6min,棄上清并收集細(xì)胞,加入紅細(xì)胞裂解液(2ml),混勻,室溫靜置2min,加入PBS緩沖液至8ml,混勻后離心并收集細(xì)胞,采用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度2×10細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化用含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)JurkatT細(xì)胞,置于37℃、5%COmrt-pcr檢測(cè)mir-33b和mycmna顯示CD4wormbft檢測(cè)納米蛋白取各組JurkatT細(xì)胞及CD4cd25和cd29表達(dá)水平收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期JurkatT細(xì)胞,用anti-CD3/28刺激JurkatT細(xì)胞24h,用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti-CD69-PE-Cy7抗體標(biāo)記后,置于流式細(xì)胞儀檢測(cè),采用FlowJo7.6軟件分析CD25和CD69平均熒光強(qiáng)度(MFI)。mtt顯示細(xì)胞克隆取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期JurkatT細(xì)胞,0.25%胰酶消化,接種至96孔板,每孔細(xì)胞密度為5×10檢測(cè)t細(xì)胞激活功能分別將JurkatT細(xì)胞鋪于96孔U底板(2×10雙捕獲光素酶活性檢測(cè)收集呈指數(shù)式生長(zhǎng)的JurkatT細(xì)胞,胰蛋白酶消化,制備細(xì)胞懸液,以每孔1×10統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0進(jìn)行分析,一般正態(tài)計(jì)量資料采用2結(jié)果擴(kuò)張性心肌病患者cd4通過qRT-PCR法檢測(cè)DCM患者CD4mir-33b在jurkatt細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)分別將miR-33bmimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)轉(zhuǎn)染至JurkatT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后采用qRT-PCR法檢測(cè)JurkatT細(xì)胞中miR-33b表達(dá),結(jié)果顯示miR-33b組JurkatT細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平顯著高于miR-con組,anti-miR-33b組JurkatT細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平顯著低于anti-miR-con組(mir-增加對(duì)jurkatt細(xì)胞增殖活性的影響MTT檢測(cè)JurkatT細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示miR-33b組JurkatT細(xì)胞增殖活性顯著低于miR-con組,anti-miR-33b組JurkatT細(xì)胞增殖活性顯著高于anti-miR-con組(野生型wt-同體共轉(zhuǎn)染及熒光活性檢測(cè)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出miR-33b與Myc3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5A。分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33bmimic共轉(zhuǎn)染至JurkatT細(xì)胞,分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con組共轉(zhuǎn)染至JurkatT細(xì)胞,檢測(cè)JurkatT細(xì)胞熒光活性,結(jié)果顯示野生型WT-Myc與miR-33bmimic共轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞熒光活性比WT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞熒光活性顯著降低(si-con與jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染后jurkatt細(xì)胞中mic蛋白表達(dá)水平的比較將MycsiRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至JurkatT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后采