克氏原螯蝦procambarusclarkii親環(huán)素蛋白a在wssv感染過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

克氏原螯蝦procambarusclarkii親環(huán)素蛋白a在wssv感染過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

母環(huán)素家族（cyclopens）是一個(gè)廣泛分布于自然界、高度保守的多功能蛋白質(zhì)家族。此外，由于cyclopens（csa）細(xì)胞中的受體蛋白，因此也被稱為csa結(jié)合蛋白（fengetal，2013）。在高等生物上的大量研究結(jié)果顯示,作為一個(gè)免疫抑制劑CypA基因參與病毒復(fù)制的中間過程,促進(jìn)病毒在機(jī)體中的復(fù)制表達(dá)(Frankeetal,1996;Zhouetal,2012),比如在HIV侵染過程中,人體CypA能影響HIV病毒的復(fù)制,CypA通過綁定HIV1的蛋白外殼富含脯氨酸的環(huán)上的GlyPro位點(diǎn),催化Pro肽鍵順反異構(gòu)化,形成有功能的蛋白外殼,通過相互作用增加了HIV1病毒在人身上的感染機(jī)率(潘克厚等,2008);豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)感染PK-15細(xì)胞后,細(xì)胞中的CypA明顯上調(diào)表達(dá),而采用RNA干擾方法下調(diào)PK-15細(xì)胞中CyPA的表達(dá),能夠抑制CSFV在細(xì)胞中的增殖(戴雅娟等,2012);傳染性脾腎壞死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)感染鱖魚實(shí)驗(yàn)表明,宿主的CypA對ISKNV的增殖起著重要的作用,通過添加其抑制劑CsA能有效抑制病毒的增殖(胡先勤等,2016)。在近年來在水產(chǎn)動物方面的研究發(fā)現(xiàn),CypA在櫛孔扇貝、池蝶蚌以及中華絨螯蟹、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦、黃顙魚、斑點(diǎn)叉尾等水生生物中可能充當(dāng)一種免疫應(yīng)激的角色(Yehetal,2008;Qiuetal,2009;Song,2009;丁兆坤等,2011;Heetal,2013;Wangetal,2013;Dongetal,2015)。但總體上而言CypA基因在水產(chǎn)動物上的研究的深度和廣度都還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足,特別是在克氏原螯蝦方面相關(guān)報(bào)道較少。白斑綜合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是一種具有囊膜的桿狀病毒(Escobedo-Bonillaetal,2007),地理分布廣、流行范圍大、傳染性強(qiáng)、發(fā)病時(shí)間短,目前尚無有效的藥物能夠控制疫情,是中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)養(yǎng)殖中的主要病原(雷質(zhì)文等,2002;Escobedo-Bonillaetal,2007;Sánchez-Paz,2010)。研究表明WSSV具有廣泛的宿主,可以感染甲殼綱十足目的大部分動物(Pradeepetal,2012)。近年來發(fā)現(xiàn)WSSV在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中也廣泛流行,給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失(丁正峰等,2008)。深入理解克氏原螯蝦免疫系統(tǒng)的特征是防控克氏原螯蝦病害的關(guān)鍵,挖掘免疫系統(tǒng)的重要功能基因是深入理解克氏原螯蝦免疫系統(tǒng)的必經(jīng)之路。為探究CypA在克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)抗病毒免疫調(diào)控方面的作用機(jī)制,本研究通過采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合組織病理分析PcCypA在WSSV感染克氏原螯蝦后在各組織中的表達(dá)情況,初步闡明PcCypA在克氏原螯蝦抗病毒免疫應(yīng)答方面的功能,為揭示克氏原螯蝦CypA基因在克氏原螯蝦免疫系統(tǒng)中的作用奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1體長和體重,養(yǎng)殖間的容積克氏原螯蝦由浙江省淡水水產(chǎn)研究所浙北公司提供,平均體長和體重分別為(8.25±0.94)cm和(23.18±8.99)g,養(yǎng)殖間的容積為0.5m1.2確定致死濃度取200只健康狀況良好的克氏原螯蝦進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),分為2步:一是采用腹節(jié)注射攻毒,通過注射不同濃度病毒懸液(100μL,200μL,300μL)確定致死濃度;二是按照致死濃度,進(jìn)行攻毒,攻毒后在0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h等不同時(shí)間點(diǎn)分別采集樣本,對照組腹節(jié)注射相同體積的0.9%的生理鹽水。1.3顯微觀察試驗(yàn)取健康蝦和WSSV感染病蝦的心臟、肌肉和肝胰腺組織,用福爾馬林固定。經(jīng)酒精脫水,石蠟包埋切片(5μm厚度),再用蘇木精-伊紅染色,中性樹膠封片后在顯微鏡(DMLB2,Leica)下觀察,用數(shù)碼攝像系統(tǒng)(DC300F,Leica)拍照。1.4r引物的篩選采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,如表1所示。對克氏原螯蝦的肝胰腺、腮絲、精巢、卵巢、心臟、肌肉、眼柄、全血等組織在不同時(shí)段的CypA基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1各組不同比例的死亡個(gè)體試驗(yàn)結(jié)果表明,WSSV病毒對克氏原螯蝦有很強(qiáng)的感染能力,對照組沒有死亡個(gè)體,而注射組均有不同比例的死亡個(gè)體。WSSV病毒感染力與注射濃度呈依賴關(guān)系(見圖1),其中注射300μL病毒懸液時(shí),在12天累計(jì)死亡率接近百分百。因此,為保證實(shí)驗(yàn)效果中,選擇注射300μLWSSV病毒懸液(LC=102.2b和肌肉組織病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),與健康蝦相比,在感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦心臟(圖2A,圖2B)和肌肉組織(圖2C,圖2D)中都出現(xiàn)了肌纖維斷裂溶解的現(xiàn)象,心臟組織中細(xì)胞排列由井然有序變得雜亂無章;在肝胰腺組織(圖2E,圖2F)中,出現(xiàn)了脂肪顆粒脫落、細(xì)胞空泡化和細(xì)胞膜溶解現(xiàn)象,表明WSSV侵染宿主成功,對宿主組織有較強(qiáng)的破壞性。2.3wssv在組織中的表達(dá)利用Real-timePCR方法分別檢測了CypA在WSSV感染后克氏原螯蝦不同組織的表達(dá)水平。在克氏原螯蝦眼柄組織(圖3A)中,72hpi(hourspostinjection)的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),24hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(88.91倍),其次是0hpi(58.50倍);48hpi之后的表達(dá)量都非常低。在克氏原螯蝦鰓絲組織(圖3B)中,48hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),72hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(79.82倍),其次是12hpi(50.24倍);整個(gè)表達(dá)圖譜顯示出前高后高中間低的特征,推測前期是機(jī)體鰓絲組織對注射的應(yīng)激反應(yīng),后期是鰓絲組織PcCypA基因?qū)SSV病毒感染的響應(yīng)。在克氏原螯蝦心臟組織(圖3C)中,96hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),36hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(150.17倍),其次是24hpi(146.70倍);整個(gè)表達(dá)圖譜顯示出高低起伏的表達(dá)特征,與鰓絲中的表達(dá)圖譜對比分析認(rèn)為,心臟CypA對WSSV感染的響應(yīng)比鰓絲對WSSV感染的響應(yīng)早24—48h。在克氏原螯蝦肝胰腺組織(圖3D)中,72hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),12hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(2452倍),其次是6hpi(1443倍);說明在前期的注射應(yīng)激響應(yīng)中,肝臟CypA的超高表達(dá)對于克氏原螯蝦機(jī)體應(yīng)對注射應(yīng)激是有重要作用的。中間24—96hpi的相對表達(dá)量很低,120hpi的表達(dá)量(421.24倍)再次上升,說明肝胰腺對WSSV感染的響應(yīng)比其他的組織都遲。在克氏原螯蝦腸組織(圖3E)中,6hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),0hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(145.87倍),其次是72hpi(59.68倍)和120hpi(44.68倍)。這表明腸對注射行為的應(yīng)激非常早,而且應(yīng)激反應(yīng)中CypA的表達(dá)量也很高,這可能與腹節(jié)注射病毒懸液的行為有關(guān),在注射過程中,針頭碰到腸組織,對腸形成了直接的應(yīng)激行為,而其他組織則是間接的應(yīng)激行為。在克氏原螯蝦肌肉組織(圖3F)中,24hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),48hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(2065倍),其次是36hpi(906.07倍)和72hpi(542.34倍)。說明肌肉組織PcCypA對WSSV·的響應(yīng)大約是從36h開始的。在克氏原螯蝦血淋巴組織(圖3G)中,48hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),12hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(489.36倍),其次是36hpi(144.44倍)。對比心臟、鰓絲和肝胰腺等血液交換較大的組織來看,血淋巴組織PcCypA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)對WSSV的響應(yīng)晚于心臟,早于鰓絲,早于肝胰腺。在克氏原螯蝦精巢組織(圖3H)中,96hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),0hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(860.62倍),其次是12hpi(217.00倍)。對比卵巢、腸、肝胰腺等內(nèi)臟組織,發(fā)現(xiàn)受腹節(jié)注射病毒懸液的行為影響,內(nèi)臟組織PcCypA均表現(xiàn)出迅速的應(yīng)激反應(yīng),表達(dá)量迅速上調(diào)。精巢與卵巢對WSSV感染的響應(yīng)在24—120h沒有明顯的響應(yīng)表達(dá)。在克氏原螯蝦卵巢組織(圖3I)中,96hpi的PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),0hpi后PcCypA的相對表達(dá)量最高(346.39倍),其次是6hpi(125.95倍)。WSSV感染下卵巢PcCypA的時(shí)序表達(dá)模式基本與精巢表達(dá)模式一致。由此可知,WSSV感染后克氏原螯蝦不同組織的CypA轉(zhuǎn)錄水平分析,可以24hpi為界,0—24hpi為注射應(yīng)激期,在此期間,眼柄、鰓絲、肝胰腺、腸、血淋巴、精巢、卵巢等組織的PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá)均有上調(diào);24—36hpi為應(yīng)激恢復(fù)期,絕大多數(shù)的組織中PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá)均出現(xiàn)了下調(diào)回落,但在心臟、肌肉、血淋巴組織中出現(xiàn)了上調(diào),說明這三個(gè)組織對WSSV感染的響應(yīng)早于其他組織;48hpi之后為WSSV感染響應(yīng)階段,在此期間鰓和肌肉組織有大量PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá),肝胰腺和精巢組織表達(dá)下調(diào);96—120hpi為感染響應(yīng)后期階段,肝胰腺和腸組織的PcCypA轉(zhuǎn)錄水平再次上調(diào)。2.4wssv感染后各組織中cypa的表達(dá)在對照組(圖4A)中,肝胰腺PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),表達(dá)量從高到底分別為腸(41.63倍)、眼柄(31.38倍)、心臟(6.27倍)、卵巢(5.80倍)、精巢(4.61倍)、鰓、肌肉和血淋巴。在WSSV感染后0hpi(圖4B),肝胰腺PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),腸PcCypA的相對表達(dá)量最高(120.91倍),其次是精巢(79.24倍)。與對照組相比,PcCypA在精巢(79.24倍)和卵巢(49.33倍)的表達(dá)都有所上調(diào),眼柄組織的PcCypA(25.84倍)表達(dá)顯著下調(diào)。在WSSV感染后6hpi(圖4C),心臟PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),肝胰臟PcCypA的相對表達(dá)量最高(196.34倍),其次是血淋巴組織(36.16倍)和鰓(27.76倍)。與對照組相比,PcCypA在肝胰腺組織的表達(dá)上調(diào)非常顯著,血淋巴組織也顯著上調(diào);PcCypA在眼柄組織(25.84倍)表達(dá)下調(diào)極顯著,心臟組織中也顯著下調(diào)。在WSSV感染后12hpi(圖4D),心臟PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),肝胰臟PcCypA的相對表達(dá)量最高(649.16倍),其次是血淋巴組織(326.70倍)。與對照組相比,PcCypA在肝胰腺組織的表達(dá)上調(diào)非常顯著,血淋巴組織也顯著上調(diào)。說明在腹節(jié)注射病毒懸液后的早期應(yīng)激反應(yīng)(0—12hpi)中,PcCypA的調(diào)控模式以肝胰腺和血淋巴的上調(diào)為主。在WSSV感染后24hpi(圖4E),肌肉PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),心臟PcCypA的相對表達(dá)量最高(314.30倍),其次是腸(27.38倍)和血淋巴組織(25.86倍)。在WSSV感染后36hpi(圖4F),腸PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),肌肉PcCypA的相對表達(dá)量最高(62.56倍),其次是血淋巴組織(16.42倍)。說明在此期間(24—36hpi)腸組織PcCypA顯著下調(diào),而肌肉PcCypA顯著上調(diào)。在WSSV感染后48hpi(圖4G),肝胰腺PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),肌肉PcCypA的相對表達(dá)量最高(1328.62倍),其次是腸(181.84倍)和心臟組織(137.78倍)。說明在24—48hpi期間,肌肉組織PcCypA持續(xù)上調(diào);在36—48hpi期間,在腸組織中的表達(dá)由下調(diào)轉(zhuǎn)為上調(diào)。在WSSV感染后72hpi(圖4H),肝胰腺PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),腸PcCypA的相對表達(dá)量最高(874.99倍),其次是肌肉(613.72倍)和鰓絲組織(362.54倍)。說明在在48—72hpi期間,肌肉和腸組織中PcCypA維持高表達(dá)水平,鰓組織表達(dá)開始上調(diào)。在WSSV感染后96hpi(圖4I),精巢PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),鰓PcCypA的相對表達(dá)量最高(114.74倍),其次是血淋巴(13.14倍)和腸組織(12.45倍)。說明在72—96hpi期間,鰓組織PcCypA維持高表達(dá)水平,精巢組織顯著下調(diào)。在WSSV感染后120hpi(圖4J),精巢PcCypA的相對表達(dá)量最低,以此為基數(shù)(1),腸PcCypA的相對表達(dá)量最高(354.31倍),其次是血淋巴(227.86倍)和鰓(101.12倍)組織(12.45倍)。說明在72—120hpi期間,鰓組織PcCypA維持高表達(dá)水平,精巢組織顯著下調(diào);96—120hpi期間,血淋巴組織PcCypA開始上調(diào)。綜上所述,WSSV感染后克氏原螯蝦各組織CypA基因在不同時(shí)間轉(zhuǎn)錄水平,以24hpi為界,0—24hpi為注射應(yīng)激期,在此期間,肝胰腺(0—12hpi)、心臟(12—24hpi)等組織的PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá)均有上調(diào)。24—36hpi為應(yīng)激恢復(fù)期,絕大多數(shù)的組織中PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá)均出現(xiàn)了回落,但在心臟、肌肉、血淋巴組織中出現(xiàn)了上調(diào),說明這三個(gè)組織對WSSV感染的響應(yīng)早于其他組織。48hpi之后為WSSV感染響應(yīng)階段,在此期間鰓和肌肉組織有大量PcCypA轉(zhuǎn)錄表達(dá),肝胰腺和精巢組織表達(dá)下調(diào)。96—120hpi為感染響應(yīng)后期階段,肝胰腺和腸組織的PcCypA轉(zhuǎn)錄水平再次上調(diào)。該綜述結(jié)果與3.3結(jié)果基本一致,說明結(jié)果基本可靠。3wssv在克氏原螯蝦體內(nèi)的組織病理分析CypA基因廣泛分布于從原核生物到高等哺乳動物的各種組織中,有研究表明CypA基因在水生生物方面具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性(王旭輝,2014;羅春,2015)、免疫疫苗候選分子(陳金桃等,2015)、趨化作用(Sherryetal,1992;Allainetal,2002;Yurchenkoetal,2002;Yehetal,2008;Damskeretal,2009;Wangetal,2014;Dongetal,2015;Guoetal,2015)、抗逆作用(王旭輝,2014)等多種生理功能。目前,CypA基因在水產(chǎn)動物上的研究的深度和廣度都還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足,特別是在克氏原螯蝦方面相關(guān)報(bào)道較少。Zhu等(2017)研究表明克氏原螯蝦CypA(ProcambarusclarkiiCyclopllilinA,PcCypA)在克氏原螯蝦肝胰腺、腮絲、精巢、卵巢、心臟和肌肉等6種組織器官中都有轉(zhuǎn)錄表達(dá),在心臟中表達(dá)量最高,其次是肌肉、腮絲、卵巢和精巢,肝胰腺中表達(dá)量最低。而CypA蛋白在克氏原螯蝦的肝胰腺、腮絲、精巢、心臟和肌肉中均有發(fā)現(xiàn),大小約17kDa,而在卵巢中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的蛋白。在本研究中通過組織病理分析發(fā)現(xiàn),與健康蝦相比,在感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦心臟和肌肉組織中均出現(xiàn)了肌纖維斷裂溶解的現(xiàn)象,心臟組織中細(xì)胞排列由井然有序變得雜亂無章;在肝胰腺組織中,出現(xiàn)了脂肪顆粒脫落、細(xì)胞空泡化和細(xì)胞膜溶解現(xiàn)象。而洪徐鵬等研究了克氏原螯蝦WSSV感染后的鰓、肝胰腺和心肌組織病理組織學(xué),結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞排列無序、細(xì)胞破裂、核仁皺縮等明顯的病理變化(洪徐鵬等,2014),此結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致,可以相互印證。此外,在本研究中注射病毒懸液感染后5—9d出現(xiàn)個(gè)體死亡高峰,此結(jié)果與潘子豪等的人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同(潘子豪等,2013),進(jìn)一步佐證克氏原螯蝦是白斑綜合征病毒的宿主之一,WSSV可以引起克氏原螯蝦的大規(guī)模死亡?，F(xiàn)有大量研究證明CypA涉及多種病理狀態(tài),包括感染和炎癥(Liuetal,1991;Sherryetal,1992;Jinetal,2000;Matsudaetal,2000;Suzukietal,2006)。Qiu等研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖刺激下,斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)CypA基因的mRNA在肝胰腺和血液中顯著上調(diào)(Qiuetal,2009)。Lu等(2013)研究了環(huán)境污染物鄰苯二甲酸(Di-2-ethylhexylPhthalate,DEHP對菲律賓蛤仔CypA等免疫相關(guān)基因的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露于4mg/L的DEHP使CypA的mRNA表達(dá)上調(diào)了4.72倍,說明CypA可能參與貝類環(huán)境應(yīng)激的免疫應(yīng)答。Song(2009)用鰻弧菌(V.anguillarum)感染櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)2、4、8、16、24和48h后,血液中CypAmRNA表達(dá)沒有顯著變化,但在性腺中卻顯著上調(diào),感染后4h和8hCypAmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別達(dá)到了22.59和7.20倍。Dong等