雞馬立克氏病火災(zāi)疫苗的免疫膠劑雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價(jià)檢測(cè)方法的建立

雞馬立克氏病火災(zāi)疫苗的免疫膠劑雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價(jià)檢測(cè)方法的建立

雞馬立克?。╩d）是由馬立克病毒科的馬立克病毒（mdv）引起的一種高度接觸性淋巴組織增生的疾病。目前，該疾病沒有有效的治療方法。雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗是目前應(yīng)用最普遍的防治雞馬立克氏病的有效手段。目前,雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的毒價(jià)測(cè)定是通過蝕斑計(jì)數(shù)完成的?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2010年版,三部)1材料和方法1.1克林威治雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗,瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。1.2雞碗10日齡SPF雞胚,種蛋購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司孵化。1.3血清基、蝦、克氏病毒苗瓊脂糖購自Sigma公司,M199培養(yǎng)基、1∶250胰蛋白酶、新生牛血清均購自GIBCO公司,雞馬立克氏病活疫苗疫苗稀釋液由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司提供。1.4細(xì)胞密度對(duì)毒價(jià)檢測(cè)的影響1.4.1雞胚成纖維細(xì)胞的制備選用生長良好的10日齡SPF雞胚,無菌取出胚體,除去雞胚的眼、腦和內(nèi)臟,使用胰酶連續(xù)消化法制備雞胚成纖維細(xì)胞;加入細(xì)胞生長液(體積百分含量90%M-199細(xì)胞營養(yǎng)液、10%新生牛血清,pH值7.2)制成細(xì)胞濃縮液,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后,分別配制成細(xì)胞濃度0.25×101.4.2細(xì)胞維持液添加量選取1支雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品,使用細(xì)胞維持液(體積百分含量98%M-199細(xì)胞營養(yǎng)液、2%新生牛血清,pH值7.4)對(duì)其進(jìn)行5×101.4.3病毒毒價(jià)的測(cè)定在接入病毒后第4天對(duì)蝕斑進(jìn)行計(jì)數(shù),陰性對(duì)照的培養(yǎng)孔無蝕斑出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)成立,在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞孔內(nèi)的蝕斑計(jì)數(shù),從左到右、從上到下一條龍地觀察每一個(gè)細(xì)胞孔中的蝕斑(有些蝕斑可能融合在一起,需要區(qū)分出蝕斑的生發(fā)中心),根據(jù)各培養(yǎng)孔的蝕斑數(shù)、接種的待測(cè)定的病毒液的體積及稀釋倍數(shù)計(jì)算出待測(cè)定的病毒液的毒價(jià)。1.6計(jì)數(shù)時(shí)間對(duì)檢測(cè)有毒率的影響細(xì)胞制備見1.4.1,配制成1.0×101.7疫苗酶蝕斑計(jì)數(shù)《中華人民共和國獸藥典》(三部,2010年版)(以下簡稱《中國獸藥典》)測(cè)定方法為:疫苗樣品用稀釋液稀釋,取適當(dāng)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種3個(gè)已長成良好單層的雞胚成纖維細(xì)胞瓶,每瓶0.2mL,置37℃吸附60min,加入含2%牛血清的M-199營養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h,棄去培養(yǎng)液,覆蓋含5%牛血清的EMEM或M-199瓊脂(糖)培養(yǎng)基,待凝固后,將瓶倒置,繼續(xù)培養(yǎng)5~7日,進(jìn)行蝕斑計(jì)數(shù)。蝕斑應(yīng)典型、清晰,形態(tài)不規(guī)則,邊緣不整齊,呈乳白色,與同時(shí)設(shè)立的參照品蝕斑一致。計(jì)數(shù)時(shí),計(jì)算同一稀釋度3瓶細(xì)胞的平均蝕斑數(shù),再計(jì)算每瓶疫苗所含蝕斑數(shù)。細(xì)胞制備見1.4.1,配制成1.0×10本方法細(xì)胞制備見1.4.1,配制成1.0×10選取3個(gè)雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品,每個(gè)樣品均進(jìn)行小量分裝,分別使用《中國獸藥典》測(cè)定方法和本方法測(cè)定同一樣品,每種方法重復(fù)測(cè)定5次,比較兩種測(cè)定方法的樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差。2結(jié)果2.1細(xì)胞充密程度培養(yǎng)的影響細(xì)胞密度對(duì)毒價(jià)檢測(cè)的影響結(jié)果見表1。細(xì)胞密度過低則導(dǎo)致細(xì)胞單層稀薄,接毒后細(xì)胞容易拉網(wǎng)脫落,蝕斑數(shù)減少;細(xì)胞過密則在接毒后培養(yǎng)中容易卷邊而導(dǎo)致整片脫落,蝕斑偏小,對(duì)計(jì)數(shù)均有影響。根據(jù)細(xì)胞單層狀態(tài)和蝕斑計(jì)數(shù)的穩(wěn)定性選擇最佳細(xì)胞接種密度是1.0×102.2病毒稀釋序列的影響對(duì)檢測(cè)有毒價(jià)格的影響試驗(yàn)進(jìn)行了不同毒價(jià)樣品的蝕斑計(jì)數(shù),毒價(jià)3000~10000PFU/羽份的病毒液均能在1×102.3計(jì)數(shù)時(shí)間對(duì)檢測(cè)有毒率的影響通過檢測(cè)一個(gè)疫苗樣品在1×102.4樣本的檢測(cè)方法正確型示聚批間誤差的計(jì)算方法是將同一待檢的病毒液小量分裝,低溫保存,分5次實(shí)驗(yàn)來測(cè)定這一待檢毒樣,5次測(cè)定的結(jié)果取對(duì)數(shù),并計(jì)算5個(gè)樣本總體的標(biāo)準(zhǔn)偏差后得到的數(shù)值。分別用《中國獸藥典》測(cè)定方法和本方法檢測(cè)同一個(gè)樣品,其樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。使用《中國獸藥典》方法重復(fù)5次測(cè)定的3個(gè)雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品毒價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.18、0.16和0.19;使用本方法重復(fù)5次測(cè)定相同3個(gè)雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗樣品毒價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.05、0.09和0.04。兩相比較可以看出,兩種方法測(cè)定結(jié)果比較接近,但本方法測(cè)定雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗毒價(jià)批間誤差更小。3細(xì)胞接種密度本研究建立了不覆蓋瓊脂方法檢測(cè)雞馬立克氏病火雞皰疹病毒毒價(jià)的方法,確定了影響檢測(cè)的重要環(huán)節(jié),其最佳細(xì)胞接種密度是1.0×10本方法縮短了檢測(cè)周期,《中國獸藥典》采用覆蓋瓊脂方法,檢測(cè)周期為8~10d,而本方法檢測(cè)周期僅為5d。本方法操作