香港海鷗型菌的分離鑒定

香港海鷗型菌的分離鑒定

香港海膽細菌（lh）是一種新發(fā)現(xiàn)的細菌，可能會導致嚴重的人類腹瀉。2001年首次由袁國勇等1對象和方法1.1腹瀉患者就醫(yī)情況于2009年4-12月選取江門市第一人民醫(yī)院、五邑中醫(yī)院、鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等醫(yī)院門診就醫(yī)的腹瀉患者804例,其中男性367例,女性392例,失訪45例,分別占45.6%、48.8%、5.6%;年齡2月齡~88歲。1.2方法1.2.1細菌培養(yǎng)和鑒定由門診護士采用無菌棉簽采集患者肛拭子標本,立即放入Cary-blair氏運送培養(yǎng)基(CB)培養(yǎng)基,48h內(nèi)送到實驗室進行細菌培養(yǎng)鑒定。同時采用自制的流行病學調(diào)查表調(diào)查腹瀉患者基本資料、發(fā)病情況、臨床癥狀、腹瀉特征、飲食史、外出旅游史等。1.2.2生化鑒定及其他生物酶活性陽性對照菌株采用HKU1菌株(香港大學微生物學系袁國勇教授惠贈);大腸埃希菌ATCC25922(廣州南方醫(yī)院檢驗科提供);18種抗生素藥敏紙片(英國OXOID公司);M-H瓊脂平板(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司),并嚴格按使用說明書配制;改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂(CMA)平皿(中國檢驗檢疫科學研究所北京陸橋技術有限責任公司),并嚴格按使用說明書進行配制;API20NE生化鑒定條(法國梅里埃公司)。恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械公司);PCR儀(北京東盛龍器械公司);離心機(德國Eppendorf公司);生物安全柜(美國FormaScientificInc公司)。1.2.3培養(yǎng)頭孢哌酮肛拭子直接劃線改良頭孢哌酮麥康凱瓊脂(CMA)平皿,其中頭孢哌酮濃度為16mg/L,同時加入濃度1%的葡萄糖,置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。1.2.4生物化學對培養(yǎng)出的可疑細菌參照《北京陸橋技術有限責任公司——香港海鷗菌檢測程序》、《香港海鷗菌檢測技術的建立與應用》方法及判定標準1.2.5陽性對照、空白對照疑似菌株特異性片段PCR擴增同步設立陽性對照、空白對照。(1)模板DNA制備:采用接種環(huán)挑取在CMA培養(yǎng)皿上典型菌落,于300μLddH1.2.6-gattgactmtag-3,aposPCR方法同上,參照文獻[1]擴增16SrRNA基因序列,引物:LPW264:5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3',LPW265:5'-GNTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增產(chǎn)物送上海Invitrogen公司進行序列測定。1.2.7內(nèi)標質(zhì)控標準藥敏實驗采用K-B紙片擴散法(KindyBauer,KB法),使用大腸埃希菌ATCC25922進行質(zhì)控,并按文獻[5]標準判斷結果。2結果2.1香港海鷗型菌的生化鑒定編號679平皿上出現(xiàn)可疑菌落,呈無色、半透明、邊緣光滑整齊、菌苔直徑約0.5~1.5mm菌落,革蘭陰性,氧化酶、過氧化氫酶、脲酶陽性,三糖鐵陰性,符合香港海鷗型菌菌落特點和生化特征。API結果顯示,除硝酸鹽還原(NO3)反應、精氨酸雙水解酶(ADH)反應、脲酶(URE)反應、癸酸鹽(CAP)反應、已二酸(ADI)反應、乙酸苯酯(PAC)反應呈陽性外,其他生化試驗均為陰性。經(jīng)鑒定為香港海鷗型菌,并將此分離株命名為江門株(JM1)。2.2pcr特殊xml段圖1目的片段長度為426bp,電泳結果可見分離株(JM1)擴增片斷與陽性對照菌株(HKU1)完全吻合。2.316個mrna基因序列分析PCR擴增結果顯示,不包括引物結合區(qū),JM1的16SrRNA基因序列長度為1360bp;與香港瑪麗醫(yī)院Yuan等2.4耐藥性和中介作用藥敏試驗結果顯示,JM1對頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢唑啉、頭孢他啶、哌拉西林、胺芐西林、克林霉素等表現(xiàn)出耐藥性;對四環(huán)素、甲硝唑等表現(xiàn)為中介;而對頭孢吡肟、亞胺培南、氨曲南、三甲氧芐氨嘧啶、環(huán)丙沙星,慶大霉素以及丁胺卡那霉素均敏感。2.5分離株病原學檢查及組織學史檢查(1)發(fā)病及轉歸:患者男性,52歲,江門市某公司雜務工。2009年10月13日16時許發(fā)病,發(fā)病時在高溫密閉環(huán)境中作業(yè)。臨床癥狀為大量腹瀉(≥2次/h)、嘔吐(≥2次/h),腹痛、惡心,黃色水樣便,輕度失水,無發(fā)熱、無里急后重,大便無異常氣味。江門市某醫(yī)院就診治療,并采集肛拭子標本,送江門市疾病預防控制中心進行病原學檢查。以急性胃腸炎急診收治,經(jīng)慶大霉素、頭孢他啶、黃連素、腹可安等治療,癥狀漸輕,4h后痊愈。(2)流行病學史:糞便病原學檢查結果顯示,志賀菌、沙門菌、副溶血弧菌及霍亂弧菌均為陰性;發(fā)病前2周無外出旅游史、無外出飲食史、無服用抗生素史、無食淡水產(chǎn)品史,但平素喜食武昌魚;既往無胃潰瘍史、無其他基礎疾