骨骼肌微損傷自體修復(fù)中蛋白質(zhì)組的作用

骨骼肌微損傷自體修復(fù)中蛋白質(zhì)組的作用

離心運動引起的骨關(guān)節(jié)損傷是骨關(guān)節(jié)肌肉損傷的常見類型，通常伴有骨關(guān)節(jié)肌肉肌力的下降、疼痛和收縮。這是影響運動員強(qiáng)度訓(xùn)練的重要因素之一。1材料和方法1.1運動動物分組5周齡雄性Wistar大鼠[許可證號:SCXK(魯)20090001],由山東大學(xué)實驗動物中心提供,在山東體育學(xué)院運動人體科學(xué)重點實驗室動物房飼養(yǎng),隨機(jī)分為安靜對照組(D組)、運動后即刻組(0h組)、運動后24h組(24h組)、運動后48h組(48h組)、運動后72h組(72h組)及運動后168h組(168h組),每組6只,共計36只。D組不進(jìn)行針對性大強(qiáng)度離心運動,其余組大鼠一次大強(qiáng)度離心運動方案參照葛新發(fā)方法進(jìn)行1.2樣品沖洗和染色取處死大鼠股四頭肌并切為直徑1mm左右塊狀樣品,于3.5%戊二醛中固定過夜,用0.1M磷酸緩沖液(pH=7.2)間隔20min沖洗,共沖洗5次,隨后經(jīng)1%鋨酸固定4h,再次重復(fù)上述沖洗步驟,乙醇脫水。采用Epon812樹脂對樣品進(jìn)行浸透、包埋、聚合并切片(LKB超薄切片機(jī)),3%醋酸鈾-檸檬酸鉛對樣本進(jìn)行染色。JEM—1200EX透射電子顯微鏡及成像系統(tǒng)(JEOL,Japan)觀察并拍照片,分析不同組別骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)1.3關(guān)于蛋白質(zhì)樣品的制備和電泳取股四頭肌樣品200mg,經(jīng)蛋白質(zhì)提取、真空干燥后用Bradford法定量1.4透射掃描系統(tǒng)采用GS-710光密度儀256色灰度和600DPI分辨率對考馬斯亮藍(lán)染色后的電泳凝膠進(jìn)行透射掃描。掃描后利用Imagemaster2DplatinumV5.0軟件對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行點檢測、背景消減,建立平均凝膠后進(jìn)行匹配、量化獲取斑點的相關(guān)信息處理。以D組電泳圖譜作參考,進(jìn)行特異蛋白質(zhì)表達(dá)量分析并對表達(dá)受到激活或者抑制的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定。1.5查詢數(shù)據(jù)分析利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對表達(dá)量具有顯著性差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,通過Mascot搜索引擎進(jìn)行查詢相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已有蛋白質(zhì)匹配情況,蛋白質(zhì)信息經(jīng)NCBIProtein數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢。查詢參數(shù)主要包括:物種來源鼠;胰蛋白質(zhì)酶水解;酶解片段不完全選擇為1;肽片段相對分子質(zhì)量最大允許誤差控制在±0.1Da。1.6統(tǒng)計分析用ImageMaster2DPlatinumV5.0分析軟件檢驗差異蛋白點相對含量的差別是否有統(tǒng)計學(xué)意義。2研究結(jié)果2.1外膜及趨勢組織對照組在無運動刺激情況下,肌細(xì)胞核、肌節(jié)、肌纖維、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰(見圖1a)。運動后即刻,大鼠股四頭肌肌細(xì)胞核及肌節(jié)清晰可見,無明顯變化,Z線清晰,基本未發(fā)現(xiàn)肌絲溶解;線粒體基本正常,未發(fā)現(xiàn)明顯腫脹(見圖1b)。運動后24h,部分肌節(jié)紊亂甚至消失,Z線斷裂,肌絲溶解;線粒體遭到嚴(yán)重破壞,出現(xiàn)高度水腫,嵴開始溶解,出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象,外膜不完整;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)模糊;細(xì)胞膜出現(xiàn)局部溶解現(xiàn)象(見圖1c)。運動后48h,肌節(jié)明顯萎縮;線粒體有受損跡象,但其結(jié)構(gòu)逐漸清晰,外膜和嵴已顯現(xiàn)(見圖1d)。運動后72h,I帶出現(xiàn)過度收縮現(xiàn)象,肌節(jié)清晰,Z線逐漸清晰;線粒體數(shù)量基本恢復(fù),但外膜未完全修復(fù)(見圖1e)。運動后168h,細(xì)胞核恢復(fù),Z線清晰可見,明暗帶分明,肌節(jié)清晰;線粒體數(shù)量進(jìn)一步恢復(fù),線粒體空泡化基本消失(見圖1f)。2.2大強(qiáng)度離心運動后，蛋白質(zhì)組的差異2.2.1iii類蛋白質(zhì)經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)一次大強(qiáng)度離心運動后即刻,大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中49種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異(圖2)。其中,44種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),表觀等電點為pH4.3~6.2,表觀分子量為25~64kDa;5種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),表觀等電點為pH4.9~6.0,表觀分子量為23~66kDa。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到22種特異蛋白質(zhì)信息中(表1),I類蛋白質(zhì)4種,其中血色素結(jié)合蛋白(hemopexin)、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶(3-mercaptopyruvatesulfurtransferase)及6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase)3種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.9~24.7倍;3-羥基異丁酸脫氫酶(3-hydroxyisobutyratedehydrogenase)表達(dá)量下調(diào)至對照組的0.53倍。II類蛋白質(zhì)13種(占特異蛋白質(zhì)總數(shù)的58.3%),其中維生素D結(jié)合蛋白(vitaminDbindingprotein)、膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5)、α1抗胰蛋白酶前體(alpha-1-antitrypsinprecursor)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、熱休克蛋白β1(heatshockproteinbeta-1)、著絲粒關(guān)聯(lián)蛋白E(Centromere-associatedproteinE)、α2-HS-糖蛋白(alpha-2-HS-glycoprotein)、乙酰水解酶(Platelet-activatingfactoracetylhydrolaseIB)及免疫球蛋白λ輕鏈蛋白質(zhì)(immunoglobulinlambdalightchain)表達(dá)量上調(diào)2.0~12.0倍之間;III類蛋白質(zhì)6種,其中,膜聯(lián)蛋白A5和Trim72蛋白(Tripartitemotifcontainingprotein72)表達(dá)量分別上調(diào)2.6倍和4.1倍,核糖體蛋白(39Sribosomalprotein)表達(dá)量下調(diào)至0.32倍;IV類蛋白質(zhì)2種,包括角蛋白9(keratin9)。2.2.2iii類蛋白質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá)情況一次大強(qiáng)度離心運動后24h,大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中64種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異(圖3)。其中,39種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),表觀等電點在pH4.2~6.5,表觀分子量在25~110kDa;25種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),表觀等電點在pH4.1~6.8,表觀分子量在21~86kDa。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到25種特異蛋白質(zhì)信息中(表2),I類蛋白質(zhì)11種,其中輔酶Q9(Coq9protein)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADHdehydrogenase)、乙?；D(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)、異檸檬酸脫氫酶(isocitratedehydrogenase)、磷酸甘油-3脫氫酶(glycerol-3phosphatedehydrogenase[NAD(+)])、血色素結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)2.3~3.9倍,磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphateisomerase)、腺苷酸激酶同工酶1(Adenylatekinaseisoenzyme1)、Tpi1蛋白(Tpi1protein,partial)、磷酸乙醇酸磷酸酶(phosphoglycolatephosphatase)表達(dá)量下調(diào)至對照組0.32~0.56倍;II類蛋白質(zhì)10種,其中蛋白酶體(26Sproteasomenon-ATPaseregulatorysubunit6)、免疫球蛋白λ輕鏈、胞內(nèi)氯離子通道蛋白1(Chlorideintracellularchannelprotein1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulatedprotein)及磷酸酶2C蛋白(Ppm2cprotein)表達(dá)量上調(diào)1.9~4.7倍,過氧化物酶體雙功能酶(peroxisomalbifunctionalenzyme)、磷酸乙醇酸磷酸酶和乙基丙二酸腦病蛋白(proteinETHE1)3種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)至0.30~0.56倍;Ⅲ類蛋白質(zhì)5種,其中,胞內(nèi)氯離子通道蛋白1表達(dá)量上調(diào)1.9倍,核糖體蛋白和過氧化物酶體雙功能酶表達(dá)量下調(diào)分別至0.37和0.30倍;Ⅳ類蛋白質(zhì)4種,包括蛋白FAM195B。2.2.3種特異性蛋白質(zhì)信息一次大強(qiáng)度離心運動后48h,大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中41種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異(圖4)。其中,33種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),表觀等電點在pH4.6~6.8,表觀分子量在22~69kDa;8種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),表觀等電點在pH4.9~6.8,表觀分子量在20.1~55kDa。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到16種特異蛋白質(zhì)信息中(表3),I類蛋白質(zhì)6種,其中異檸檬酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白及乙?；D(zhuǎn)移酶共5種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.1~3.4倍,腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)量下調(diào)至對照組0.26倍;II類蛋白質(zhì)7種,其中蛋白酶體β6、已異戊二烯二羥安息香酸甲基轉(zhuǎn)移酶(hexaprenyldihydroxybenzoatemethyltransferase)、維生素D結(jié)合蛋白、磷酸酶2C蛋白及結(jié)合珠蛋白前體(haptoglobinprecursor)共5種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)2.0~4.9倍,熱休克蛋白β-2(heatshockproteinbeta-2)和熱休克蛋白β-1共2種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)至0.56倍和0.37倍;III類蛋白質(zhì)4種,Trim72蛋白(Tripartitemotif-containingprotein72)、Ⅱ型細(xì)胞骨架1角蛋白(Keratin)、維生素D結(jié)合蛋白表達(dá)量上調(diào)3.4~5.6倍,核糖體蛋白表達(dá)量下降至0.63倍。2.2.4人才培養(yǎng)信息檢測一次大強(qiáng)度離心運動后72h,大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中36種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異(圖5)。其中,32種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),表觀等電點在pH4.3~6.2,表觀分子量在27~59kDa;4種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),表觀等電點在pH4.6~6.2,表觀分子量在20.1~29kDa。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到18種特異蛋白質(zhì)信息中(表4),I類蛋白質(zhì)6種,其中異檸檬酸脫氫酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、血色素結(jié)合蛋白、輔酶Q9和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶共5種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)2.4~4.0倍,磷酸丙糖異構(gòu)酶表達(dá)量下調(diào)至對照組的0.30倍;II類蛋白質(zhì)5種,其中維生素D結(jié)合蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶2C蛋白及鳥嘌呤脫氨酶(guaninedeaminase)表達(dá)量上調(diào)2.8~6.9倍;Ⅲ類蛋白質(zhì)7種,胎球蛋白A、核糖體蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、肌球蛋白1/3輕鏈(myosinlightchain)、載脂蛋白A-I前蛋白原(apolipoproteinA-Ipreproprotein)、鳥嘌呤脫氨酶及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白29(endoplasmicreticulumresidentprotein29)表達(dá)量上調(diào)1.8~4.1倍。2.2.5種常見蛋白質(zhì)表達(dá)量和形態(tài)鑒定一次大強(qiáng)度離心運動后168h,大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)組表達(dá)譜中16種蛋白質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異(圖6)。其中,11種蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào),表觀等電點在pH4.1~6.5,表觀分子量在25~57kDa;5種蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào),表觀等電點在pH4.6~6.2,表觀分子量在22~38kDa。經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到7種特異蛋白質(zhì)信息中(表5),I類蛋白質(zhì)中異檸檬酸脫氫酶和輔酶Q9蛋白質(zhì)表達(dá)分別上調(diào)2.3和3.3倍,腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)量下調(diào)至對照組0.33倍;Ⅲ類蛋白質(zhì)3種,其中肌鈣腔蛋白、3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶及鳥嘌呤脫氨酶表達(dá)量上調(diào)2.5~3.8倍;Ⅲ類蛋白質(zhì)和Ⅳ類蛋白質(zhì)中分別有鳥嘌呤脫氨酶和14-3-3ε蛋白表達(dá)量分別上調(diào)3.8倍和2.3倍。2.2.6蛋白表達(dá)情況差異一次大強(qiáng)度離心運動后即刻至1周之內(nèi),蛋白質(zhì)表達(dá)主要以上調(diào)為主,蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)主要在運動后24~48h之間(圖7)。從蛋白質(zhì)表達(dá)種類分析,I類蛋白質(zhì)差異性表達(dá)上調(diào)次數(shù)為25次,下調(diào)表達(dá)次數(shù)8次,特別是運動后24~48h之間上調(diào)表達(dá)次數(shù)為13次,占上調(diào)表達(dá)次數(shù)的56.5%;Ⅱ類蛋白質(zhì)在運動后即刻表達(dá)上調(diào)為主,表達(dá)上調(diào)蛋白數(shù)量為14種,未出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì),隨后上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)量逐漸下降,而在24h時出現(xiàn)4個下調(diào)蛋白;Ⅲ類蛋白質(zhì)表達(dá)主要體現(xiàn)在48h組和72h組,上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量分別為4種和7種,下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量分別為1種和0種。對特異表達(dá)蛋白質(zhì)變化頻次分析發(fā)現(xiàn)(表6),I類蛋白質(zhì)中分別有異檸檬酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白、輔酶Q9、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、乙?；D(zhuǎn)移酶在微損傷后24~72h之間表達(dá)活躍并以表達(dá)量上調(diào)為主,腺苷酸激酶同工酶1表達(dá)以下調(diào)為主;Ⅱ類蛋白質(zhì)中磷酸酶2C蛋白、熱休克蛋白β-1、免疫球蛋白λ輕鏈、結(jié)合珠蛋白前體、維生素D結(jié)合蛋白、鳥嘌呤脫氨酶表達(dá)頻次較高,其中熱休克蛋白β-1在0h表達(dá)量上調(diào),至48h表達(dá)量下降至正常水平的0.37倍,其余蛋白表達(dá)量在0h時均有顯著上升,在24~72h之間各蛋白表達(dá)規(guī)律不盡相同,主要以表達(dá)上調(diào)為主;Ⅲ類蛋白質(zhì)中核糖體蛋白在0~48h之間表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降,在72h時表達(dá)量上調(diào)至對照組的2.8倍。3次大強(qiáng)度離心運動后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化大強(qiáng)度下坡跑可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化,這種變化與骨骼肌損傷修復(fù)過程中炎癥消除、肌纖維重建過程密切關(guān)聯(lián),說明機(jī)體對大強(qiáng)度離心運動造成的微損傷能通過機(jī)體自身調(diào)節(jié)進(jìn)行補(bǔ)償大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)在運動后即刻組中未見有明顯變化,說明運動后即刻微損傷尚未完全顯現(xiàn)運動后24~72h,骨骼肌中線粒體遭到嚴(yán)重破壞,出現(xiàn)高度水腫,嵴開始溶解,出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象,外膜不完整現(xiàn)象逐漸恢復(fù)至線粒體嵴逐漸清晰,外膜基本完整,說明這個階段是損傷骨骼肌亞細(xì)胞恢復(fù)的主要時期與對照組比較,Ⅲ類蛋白質(zhì)的表達(dá)主要集中在運動后48h和72