第4章免疫分析及免疫傳感器

第4章免疫分析及免疫傳感器4.1引言4.2抗體-抗原相互作用4.3免疫分析及免疫傳感器4.4抗體固定模式4.5化學(xué)發(fā)光檢測(cè)4.6電致化學(xué)發(fā)光（ECL)4.7電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)4.8微流控電化學(xué)免疫分析系統(tǒng)4.9結(jié)論4.1引言臨床、生物電化學(xué)及環(huán)境分析物的檢測(cè)需要快速、簡(jiǎn)便的分析方法基于抗體-抗原相互作用的免疫分析及免疫傳感器由于其特異性及靈敏性顯示良好的前景抗體與被分析物（通常指抗原）在免疫分析體系或免疫傳感器界面形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過分子識(shí)別達(dá)到高度的特異性靈敏度取決于以下幾個(gè)方面：采用與分析物高親和性特異結(jié)合的抗體；抗體在免疫分析或免疫傳感器界面的固定排列方式；合適的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)放射免疫分析：放射活性物半衰期短、損害健康、污物難處理等光學(xué)免疫分析：對(duì)于有色樣品及不純樣品檢測(cè)的靈敏性有一定限制電化學(xué)免疫分析及免疫傳感器：快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，微型化，均相檢測(cè)本章主要介紹一些基礎(chǔ)背景知識(shí)，包括抗體結(jié)構(gòu)和抗體-抗原相互作用，這對(duì)所有采用特殊的免疫分析模式的免疫分析和免疫傳感器來說，都是至關(guān)重要的因素。重點(diǎn)介紹電化學(xué)免疫分析和免疫傳感器的發(fā)展現(xiàn)狀，以便能夠比較容易地理解該領(lǐng)域取得的成就，并加以應(yīng)用。

4.2抗體-抗原相互作用免疫分析和免疫傳感器都是通過抗體對(duì)抗原的特異性分子識(shí)別來進(jìn)行分析的系統(tǒng)?？贵w是一類稱為免疫球蛋白（Ig）的糖蛋白，通常分為5類（IgA、IgG、IgM、IgD、IgE），其中IgG是最主要的成分（約占70%），經(jīng)常用于免疫分析技術(shù)中。抗體分類

根據(jù)重鏈C區(qū)氨基酸組成及排列順序不同抗體可分為五類L鏈L鏈H鏈H鏈N端C端四肽鏈結(jié)構(gòu)

鏈間二硫鍵連接，呈“Y”形兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈上部為N端，下部為C端根據(jù)氨基酸排列順序的不同分為：可變區(qū)(VariableRegion）和恒定區(qū)（ConstantRegion）可變區(qū)（V區(qū)）：氨基酸組成、排列順序變化較大恒定區(qū)（C區(qū)）：氨基酸數(shù)量、種類、排列順序及含糖量都比較穩(wěn)定可變區(qū)與恒定區(qū)鉸鏈區(qū)根據(jù)氨基酸序列的可變性，可分為恒定區(qū)（C區(qū)）和可變區(qū)（V區(qū)）圖4.1抗體Y型結(jié)構(gòu)示意圖。介于重鏈和輕鏈之間的區(qū)域即為抗原結(jié)合區(qū)域，“Y”型的開臂部分記為F(ab')2,而底部無抗原結(jié)合活性的區(qū)域記為Fc。其中，K為反應(yīng)平衡時(shí)的速率常數(shù)；Ab-Ag為抗體-抗原復(fù)合物。K的范圍為106~1012Lmol-1，通常只有親和常數(shù)K較大的抗體（≥108Lmol-1）顯示較低的交叉反應(yīng)性。抗體（Ab）-抗原（Ag）的結(jié)合遵循以下平衡方程：這些性質(zhì)使得許多抗體成為免疫分析及生物傳感器設(shè)計(jì)中理想的生物識(shí)別成分。

單克隆抗體特別適用于免疫分析。單克隆抗體是由單一細(xì)胞系合成的，因此具有相同的抗原決定簇特異性和親和性，是可以大量制備的均質(zhì)抗體。與多克隆抗體相比，單克隆抗體顯示更高的特異性和均質(zhì)性，可減少純化步驟。4.3免疫分析及免疫傳感器免疫分析是一種利用抗體作為待測(cè)抗原（通常為被分析物）的主要結(jié)合試劑來進(jìn)行定量分析的方法。免疫分析的最終結(jié)果通常是研究抗體-抗原之間的結(jié)合，以及游離抗原與抗原-抗體復(fù)合物之間的識(shí)別。所有的免疫分析都是基于測(cè)定識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合率，即測(cè)定結(jié)合位點(diǎn)數(shù)或間接測(cè)定未結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。免疫分析基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段；免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。免疫的原理

Ag+AbAg－Ab

特異性、靈敏性在Ag，Ab反應(yīng)中，用容易示蹤的化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記一種反應(yīng)物，以了解反應(yīng)是否發(fā)生，發(fā)生部位，以及發(fā)生的程度（即對(duì)未知成分的樣品進(jìn)行定性、定位及定量分析）。免疫學(xué)檢測(cè)歷史演進(jìn)放射免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)（20世紀(jì)90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。4.3.1酶聯(lián)免疫法免疫酶技術(shù)：把抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來。它具有免疫熒光試驗(yàn)和放射免疫試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，并克服上述兩種方法的缺點(diǎn)。酶標(biāo)記試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長(zhǎng)，免疫酶技術(shù)的敏感性接近放射免疫試驗(yàn)，可直接肉眼觀察也可借助簡(jiǎn)單的儀器作定量測(cè)定，所得結(jié)果比較客觀。酶免疫測(cè)定或免疫酶技術(shù)是指酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它主要包括兩個(gè)方面：免疫過氧化物酶法：以過氧化物酶作為標(biāo)記，與抗原或抗體結(jié)合，然后根據(jù)酶與其底物間所產(chǎn)生的不溶性顏色產(chǎn)物，借助于光學(xué)或電子顯微鏡觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的抗原或抗體。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)：根據(jù)可溶性抗原或抗體與不溶性固相載體結(jié)合后，還保留其免疫活性，結(jié)合了作為標(biāo)記的酶催化作用。

ELISA的基本原理和方法

ELISA的種類和變化

ELISA的特點(diǎn)

ELISA的應(yīng)用實(shí)例ELISA4.3.1.1基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量成正比，因此可借助于顏色反應(yīng)的深淺來定量抗體或抗原。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便迅速，特異性強(qiáng)。4.3.1.2酶及其底物

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng)。酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲基聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

4.3.1.3ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）捕獲法測(cè)IgM抗體重點(diǎn)（一）雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等步驟：A將已知抗體吸附于載體上，溫育后清洗；B加入待檢標(biāo)本溶液，使溶液中的抗原與吸附的抗體結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標(biāo)記特異性抗體，溫育后清洗；D加入酶作用底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色的改變與所加的待檢標(biāo)本溶液中的抗原量成正比。1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標(biāo)抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY（二）間接法方法

用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定步驟：A將已知可溶性抗原吸附于載體（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），經(jīng)溫育后清洗；B加入待檢稀釋血清，若血清中有相應(yīng)特異性抗體存在則與吸附的抗原結(jié)合，溫育后清洗；C加入酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體，此時(shí)酶標(biāo)記抗抗體與吸附的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，溫育后清洗；D加入酶作用底物（或稱基質(zhì)），酶分解底物并顯色，用光電比色計(jì)測(cè)定底物顯色深淺，即可推知抗體量。1、已知抗原吸2、加待檢物3、加酶標(biāo)抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗體吸2、加待檢物3、加酶標(biāo)的抗Ig4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+（三）競(jìng)爭(zhēng)法

方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）步驟：A將已知抗體吸附于固相載體表面，溫育后清洗；B將可能含抗原的待檢溶液和酶標(biāo)記的已知抗原溶液以適當(dāng)比例混合，加入已包被的載體孔中，溫育后清洗；C加入酶作用的底物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。色深表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原多，而待檢溶液中未標(biāo)記的抗原量少；反之，色淺表示結(jié)合的酶標(biāo)記抗原少，而待檢溶液中抗原量多。洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE

對(duì)照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測(cè)定管的顯色程度則隨待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的結(jié)果而異。如待測(cè)抗原量多，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體（四）捕獲法捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色

洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色4.3.2競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析體系

圖4.2競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析示意圖將樣品與已標(biāo)記待測(cè)物混合后再去競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)標(biāo)記復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)與樣品中待測(cè)物的量成反比關(guān)系

基于競(jìng)爭(zhēng)免疫分析的免疫傳感器用來檢測(cè)小分子物質(zhì)雌二醇

圖4.3競(jìng)爭(zhēng)免疫分析檢測(cè)雌二醇的結(jié)構(gòu)示意圖E.Zacco,R.Galve,M.P.Marco,S.Alegret,M.I.Pividori,Biosens.

Bioelectron.22(2007)1707.Fig.6.SchematicrepresentationoftheelectrochemicalcompetitiveimmunosensingstrategyforthedetectionofatrazineinorangejuicewithProtA-GEB-basedbiosensors,showingtheimmobilization(AandB)andthecompetitiveimmunologicalreaction(C).競(jìng)爭(zhēng)性電化學(xué)免疫分析和免疫傳感器還廣泛應(yīng)用于重要的臨床分析物的檢測(cè)。盡管競(jìng)爭(zhēng)免疫分析比較簡(jiǎn)單，但其缺點(diǎn)在于待測(cè)物標(biāo)記后與抗體的結(jié)合能力可能減低甚至消失，特別是當(dāng)標(biāo)記物靠近抗原決定簇時(shí)，此現(xiàn)象尤為突出。

非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析體系（即雙抗體夾心免疫分析）通過過量的抗體與抗原反應(yīng)，使抗原與樣品溶液分離，形成的免疫復(fù)合物再與過量的信號(hào)二抗反應(yīng)，其中二抗只特異性地與固定的抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合。

4.3.3非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析體系

非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析（b）示意圖通常需要加入封閉劑減少非特異性反應(yīng)當(dāng)檢測(cè)體系中信號(hào)抗體的量過多時(shí)也應(yīng)考慮非特異性吸附問題該法特異性強(qiáng)，但只適用于兩個(gè)抗原決定簇能夠同時(shí)被識(shí)別的待測(cè)物的定量分析

利用非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析體系檢測(cè)食品中的致病菌

圖4.4流動(dòng)免疫傳感器的示意圖。（1）液體進(jìn)口，（2）碳集電器，（3）可棄免疫柱，（4）高度分散的抗體修飾的碳顆粒（免疫吸附劑），（5）碳對(duì)電極，（6）Ag/AgCl參比電極，（7）液體出口。

對(duì)斯特桿菌的檢測(cè)限為10cellmL-1，線性范圍10~1500cellmL-1。

4.4抗體固定模式

捕獲抗體在固相表面的固定方式是一個(gè)關(guān)鍵的問題比較理想的固定方法是所固定的捕獲抗體以空間位阻最小的方式排列，易于與目標(biāo)抗原反應(yīng)抗體固定后與抗原的結(jié)合能力沒有明顯改變這些性質(zhì)與免疫體系所能達(dá)到的靈敏度和動(dòng)力學(xué)范圍有直接關(guān)系抗體固定技術(shù)：共價(jià)鍵合法、物理吸附法、聚合物靜電/物理包埋法

4.4.1生物素-（鏈霉）親和素相互作用

生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。多級(jí)放大效應(yīng)-靈敏生物素與親和素之間高度親和力-特異穩(wěn)定適用性強(qiáng)（與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合）圖4.5兩種免疫傳感器的示意圖：（a）基于生物素-鏈霉親和素相互作用的免疫傳感器；(b)基于兔IgG修飾的SPCE的免疫傳感器。

兔抗鼠抗體鼠抗體利用蛋白A-環(huán)氧石墨生物復(fù)合體進(jìn)行免疫分析，激光誘導(dǎo)熒光顯微鏡檢測(cè)RIgG。4.4.2抗體結(jié)合蛋白質(zhì)

細(xì)菌抗體結(jié)合蛋白質(zhì)是免疫分析中另一種基于親和作用的抗體固定技術(shù)，最常用的是蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G。特異地與抗體的非抗原結(jié)合區(qū)域（Fc）作用，使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離固定相表面，易于與待測(cè)物反應(yīng)。均可以直接與抗體的Fc部位結(jié)合，不需要對(duì)抗體進(jìn)行生物素化修飾。蛋白質(zhì)A的分子量約為42kDa，最初是從金黃色葡萄球菌（staphylococcusaureus）的細(xì)胞壁中分離出的。圖4.6以蛋白質(zhì)A-GBE為轉(zhuǎn)換器的免疫傳感器示意圖。（a）通過與蛋白質(zhì)A作用固定RIgG，（b）抗RIgG

抗體和生物素標(biāo)記的抗RIgG

抗體的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，（c）通過鏈霉親和素-HRP標(biāo)記酶，（d）電化學(xué)檢測(cè)酶活性。檢測(cè)抗RIgG抗體的范圍為2pmol-10pmol

以蛋白質(zhì)A修飾的石墨環(huán)氧樹脂生物復(fù)合物（ProteinA-GBE）為剛性支架，不但可以固定抗體，還可作為電化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換器。生物復(fù)合材料膜的制備：將石墨粉與環(huán)氧樹脂按質(zhì)量比1?4的比例混合，再加入蛋白質(zhì)A使其最終濃度為2%（W/W），得糊狀物。將糊狀物裝入帶有電氣插頭的圓柱型模具，壓實(shí)，保持一星期。通過在Al2O3紙上研磨拋光，形成光滑的鏡面，使蛋白質(zhì)A露于表面，蛋白質(zhì)A-石墨環(huán)氧樹脂膜還可以重復(fù)使用。5.4.3導(dǎo)電聚合物

導(dǎo)電聚合物，如聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩等，已廣泛應(yīng)用于免疫分析體系中捕獲抗體的固定，可用于電流型、電位型及阻抗型免疫分析體系。導(dǎo)電聚合物可以在酶和電極表面之間提供一條電子轉(zhuǎn)移通道，而不需要介質(zhì)來傳遞電子。利用導(dǎo)電高分子容易實(shí)現(xiàn)“無試劑”或“無標(biāo)記”免疫傳感器。利用導(dǎo)電聚合物固定抗體的方法通常是將抗體包埋于聚合鏈中。利用含有抗體的單體溶液，抗體和聚合物可以同時(shí)固定在傳感器表面。然而包埋法可能使抗體變性，失去活性。而且大部分的抗體包埋于聚合物基底中，不能與抗原結(jié)合。另一種方法是先將導(dǎo)電聚合物膜修飾到電極上，利用其活性基團(tuán)共價(jià)鍵合抗體。圖4.7基于TTCA膜的電極制備及信號(hào)產(chǎn)生示意圖Darain等報(bào)道了一種基于聚(三噻吩羧酸酯)（TTCA）修飾絲網(wǎng)印刷碳陣列（SPCA）的電流型免疫傳感器，用于檢測(cè)前體蛋白卵黃原蛋白（Vtg）。

競(jìng)爭(zhēng)免疫分析4.4.4自組裝單層膜

自組裝單層膜（SAMs）是免疫分析體系中另一種抗體固定方法。利用烷烴硫醇與Au、Ag等金屬的固有化學(xué)吸附性可形成高度有序的單層膜。Au電極由于不受周圍環(huán)境影響發(fā)生氧化反應(yīng)而常被用作工作電極。首先烷烴硫醇通過Au-S鍵在Au電極表面形成烷烴硫醇自組裝單層膜。目前被普遍接受的解釋Au-S鍵形成的模式是，第一步S-H鍵氧化加成到Au表面，還原消除氫，見方程（2）所示。圖4.8烷烴硫醇鏈在SAM修飾的金電極表面形成的20°-30°傾斜角的示意圖ω-碳取代的烷烴硫醇形成的SAM表面包含游離的羧基，活化后可與捕獲抗體或其它蛋白質(zhì)的賴氨酸上的氨基共價(jià)結(jié)合?？贵w除了可以通過共價(jià)鍵結(jié)合到SAM上，還可以通過靜電作用結(jié)合到帶電的SAM膜上。

IgG通過“頭部”吸附到帶有-COOH的SAM上，而以“尾部”和“側(cè)面”兩種方式吸附到帶有-NH2端基的SAM上。S.Chen,L.Liu,J.Zhou,Langmuir,2003,19,2859-2864研究了不同表面和溶液性質(zhì)對(duì)抗體吸附排列方式的影響

5.4.5抗體片段

抗體的片段化可以通過糜蛋白酶、胰島素、木瓜蛋白酶等蛋白水解酶催化完成。酶降解后，用以連接所生成的兩條F(ab')2鏈的二硫鍵可以被二硫蘇糖醇或２-巰基乙胺等試劑還原，而生成兩個(gè)Fab'片段。每個(gè)片段末端都帶有硫基，所以與金表面有很高的親和性，不需另外加試劑就可自組裝到金表面。形成的SAM呈有序排列，抗原結(jié)合區(qū)域很容易與抗原結(jié)合。L鏈L鏈H鏈H鏈N端C端Zhang和Meyerhoff報(bào)道了一種基于Fab'片段固定于包被金的磁性粒子上的免疫分析方法，用于檢測(cè)C活性蛋白（CRP）Anal.Chem.2006,78,609-616甲苯磺酰基Figure2.SEMimagesof(A)M-500(4.5-ímdiameter)uncoatedmagneticparticlesand(B)gold-coatedM-500magneticparticles.將包被金的磁珠與抗CRPFab‘片段于4°C孵育過夜，抗CRPFab’片段固定于磁珠表面，然后與不同的CRP反應(yīng)，以吸光度對(duì)CRP濃度做工作曲線，檢測(cè)限可達(dá)到0.14ngmL-1。通過Fab'片段上的氨基與未包被的磁珠發(fā)生甲苯磺?；磻?yīng)共價(jià)鍵合的，檢測(cè)限為1.9ngmL-1。

4.5化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。

請(qǐng)你們猜一道謎題：夜晚不休息，提燈四處巡，明滅草叢間，好似點(diǎn)點(diǎn)星。猜一種昆蟲螢火蟲公佈謎底螢火蟲為什麼會(huì)發(fā)光？是由身體哪個(gè)部位發(fā)光的？吃什麼東西？哪個(gè)地方看得到螢火蟲？這些問題，在接下來的投影片中都有提到，請(qǐng)仔細(xì)聆聽喔！START螢火蟲發(fā)光雄螢雌螢〈身形較大〉神奇的海底你知道嗎？海面上波濤洶涌的時(shí)候，海底依然很寧靜。最大的風(fēng)浪，也只能影響到海面一下幾十米深。陽光射不到海底，水越深光線越暗。五百米以下就全黑了。在這片黑暗的深海粒，卻有許多光點(diǎn)像閃爍的星星，那是有發(fā)光器的深海魚在游動(dòng)。海底真是個(gè)景色奇異，物產(chǎn)豐富的世界。海底剪輯點(diǎn)擊海底剪輯，會(huì)讓你一飽眼福！美麗的圖片深海魚發(fā)光神奇的海底海底動(dòng)物發(fā)光分類光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光。生物發(fā)光：反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出。化學(xué)發(fā)光根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:化學(xué)發(fā)光

Chemiluminescence(CL)化學(xué)發(fā)光是指在某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)關(guān)鍵步驟，即化學(xué)激發(fā)和發(fā)光。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)能級(jí)圖

一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可簡(jiǎn)單地描述如下：

A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。

若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可表示如下：

A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ

化學(xué)發(fā)光分析根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱為化學(xué)發(fā)光分析?；瘜W(xué)發(fā)光分析優(yōu)點(diǎn)化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響，有很高的靈敏度，并且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光分析缺點(diǎn)雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個(gè)方法的使用?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析

chemiluminescenceimmunoassay（CLIA）CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。

化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）分類按分離方法不同分微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。

4.5.1化學(xué)發(fā)光劑能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性。

㈠直接化學(xué)發(fā)光劑

直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。

1.

吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。

2．三聯(lián)吡啶釕

三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕

㈡酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。

1．魯米諾及其衍生物

2．AMPPD1．魯米諾圖4.9魯米諾發(fā)光原理圖4.10魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕1.碳二亞胺（EDC）縮合法

4.5.2發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)2.過碘酸鈉氧化法

3．重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法

1．發(fā)光劑的選擇

2．被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)

3．標(biāo)記方法的選擇

4．原料比

5．標(biāo)記率

6．溫度

7．純化與保存影響標(biāo)記的因素

用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。4.5.3直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分易分離磁微粒技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme

immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。4.5.4

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。㈠辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析圖4.11辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。

㈡堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析圖4.12堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖

分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應(yīng)物結(jié)合在磁場(chǎng)中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號(hào)孵育,促使信號(hào)的產(chǎn)生信號(hào)檢測(cè)4.6電致化學(xué)發(fā)光（ECL)電致化學(xué)發(fā)光(ECL)是通過在電極上施加一定波形的電壓或電流信號(hào)進(jìn)行電解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組分反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象。電致化學(xué)發(fā)光（ECL)ECL與CL的差異在于ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，而CL是通過化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。因此ECL反應(yīng)易精確控制，具有靈活性。4.6.1

電化學(xué)發(fā)光劑定義：指通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點(diǎn)反應(yīng)在電極進(jìn)行化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)吡啶釕電子供體為：三丙胺（TPA）三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖三聯(lián)吡啶釕

（[Ru(bpy)3]2+

）特點(diǎn)ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作為標(biāo)記物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羥基琥珀酸胺酯（NHS），該衍生物具有水溶性，且高度穩(wěn)定，保證電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高效和穩(wěn)定，而且避免了本底噪聲的干擾。三聯(lián)吡啶釕（[Ru(bpy)3]2+

）特點(diǎn)[Ru(bpy)3]2+衍生物與免疫球蛋白結(jié)合的分子比超過20仍不會(huì)影響抗體的可溶性和免疫活性；[Ru(bpy)3]2+分子量小，空間位阻小，即便小分子的核酸也能標(biāo)記，使檢測(cè)的菜單大大豐富，更重要的是為其檢測(cè)菜單的開發(fā)前景提供了廣闊空間。電化學(xué)發(fā)光原理圖基態(tài)激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定二丙胺+丙醛4.6.2

電化學(xué)發(fā)光免疫分析

(Electro-ChemiluminescenceImmunoassay,ECLI)ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（TRFIA）之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)；ECLI是電化學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物；ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一。

ECLI原理在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。圖4.13電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖圖4.14電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖圖4.15標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖ECLIA檢測(cè)流程圖一（雙抗體夾心的形成）ECLIA檢測(cè)流程圖二（生物素與親和素結(jié)合）ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖ECLIA檢測(cè)流程圖三（磁珠吸引吸附于電極表面）ECLIA檢測(cè)流程圖四（電極充電啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)）ECLIA檢測(cè)流程圖五（撤消磁場(chǎng)沖洗磁珠）方法評(píng)價(jià)采用的固相載體是帶有磁性的直徑約2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特點(diǎn)是反應(yīng)面積比板式擴(kuò)大20－30倍，吸附效率高；在液體中形成均勻的懸液，參與反應(yīng)時(shí)類似液相，反應(yīng)速度大大加快；方法評(píng)價(jià)“鏈霉親和素-生物素”是具有很強(qiáng)的非共價(jià)相互作用的一對(duì)化合物，具有牢固而特異的結(jié)合，應(yīng)用此放大系統(tǒng)，使檢測(cè)的靈敏度大大提高；方法評(píng)價(jià)利用氧化鐵的磁性，使用電磁場(chǎng)分離結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，方便迅速，實(shí)現(xiàn)了精確的全自動(dòng)化；標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高、易于測(cè)定?；贑dS

量子點(diǎn)-CNT-AuNP-殼聚糖的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器研究PDCNT：聚乙二胺-CNTFig.1.(A)ECL-timecurvesof(a)PDCNTs/Auelectrode,(b)CdS

QDs/Auelectrode,and(c)CdS

QDs-PDCNTs/Auelectrode.(B)ECL–potentialcurveandcyclicvoltammogram(inset)ofCdS

QDs-PDCNTs/Auelectrode(PMT:600V).ECL–potentialcurvesof(a)PDCNTs,(b)(a)+CdS

QDs,(c)(b)+GNPs-CHIT,(d)(c)+Ab,and(e)(d)+HIgGmodifiedAuelectrodes(PMT:600V),andECLemissionfromtheimmunosensorfor34cycles(inset)(PMT:800V).RepresentativeSEMimagesof(A)PDCNTs,(B)(A)+CdS

QDs,(C)(B)+GNPs-CHIT,(D)(C)+AbmodifiedAuelectrodes.Fig.3.ECLresponsesoftheimmunosensorwithdifferentconcentrationsofHIgG(a–h).HIgGconcentration(ngmL-1):(a)0,(b)0.006,(c)0.06,(d)0.6,(e)3,(f)6,(g)60,and(h)150.(Inset)CalibrationcurveforHIgGdetermination.ELIA優(yōu)越性高度敏感，可達(dá)pg／ml或pmol水平；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV＜5％。測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長(zhǎng)，達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國(guó)家，CLIA成了取代RIA的首選方法。臨床應(yīng)用激素腫瘤標(biāo)記物內(nèi)分泌功能傳染性疾病其它如VB12、葉酸、鐵蛋白、肌鈣蛋白、肌紅蛋白、酶、脂肪酸、維生素和藥物等多種檢測(cè)項(xiàng)目。

4.7電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

電化學(xué)檢測(cè)由于其自身的優(yōu)點(diǎn)常用于生物傳感器研究，成為免疫傳感器中研究最早、種類最多、也較為成熟的一個(gè)分支。

電化學(xué)轉(zhuǎn)換的高靈敏性易與現(xiàn)代微型化/微加工技術(shù)兼容較低的能源需求不受樣品的濁度及顏色的影響

電化學(xué)免疫傳感器的基本工作原理是：采用電化學(xué)檢測(cè)方法來檢測(cè)標(biāo)記的免疫試劑或者一些由酶、金屬離子和其他電活性物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)記物，從而對(duì)疾病診斷或病人狀態(tài)監(jiān)測(cè)中復(fù)雜體系的多組分混合物進(jìn)行分析，提供有力數(shù)據(jù)。根據(jù)信號(hào)的類型可分為電位法、電流法、伏安法以及最近發(fā)展的電化學(xué)阻抗檢測(cè)4.7.1電位型免疫傳感器

電位型免疫傳感器是基于測(cè)量抗體、抗原免疫反應(yīng)后指示劑與參比電極之間的電位變化來進(jìn)行免疫分析的。有關(guān)基于電位檢測(cè)的免疫傳感器的研究報(bào)道較少該檢測(cè)方法一個(gè)主要的缺點(diǎn)就是抗體-抗原發(fā)生免疫分析后電位變化不大。而且，樣品基底的干擾會(huì)使這種小的信號(hào)變化難以準(zhǔn)確檢測(cè)，所以電位型傳感器的可靠性及靈敏性較差。一種電位型免疫傳感器，在聚吡咯修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面檢測(cè)酶標(biāo)免疫復(fù)合物首先在含有吡咯單體和十二烷基硫酸鈉的溶液中，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至少4次，形成電聚合膜修飾電極。然后在電極上加一恒電位使聚吡咯膜達(dá)到其最終狀態(tài)。所形成的聚吡咯膜修飾電極在37°C時(shí)可以保存4個(gè)月，而且顯示良好的靈敏性。捕獲抗體可以通過直接吸附作用固定在聚吡咯膜上，也可以將生物素修飾的抗體結(jié)合到鏈霉親和素修飾的聚吡咯膜上。然后將電極與含有乙肝表面抗原或心肌肌鈣蛋白I的樣品溶液孵育，再加入HRP標(biāo)記的抗體進(jìn)行夾心式免疫分析。加入活性底物二氯鄰苯二胺60s后，在0.01MPBS（pH7.4）中進(jìn)行電位檢測(cè)，記錄電位。4.7.2電流型免疫傳感器

電流檢測(cè)中，在恒電壓下電活性分析物在電極上產(chǎn)生的氧化或還原電流強(qiáng)弱與待測(cè)物濃度成正比。由于抗體和抗原本身并沒有電化學(xué)活性，所以在免疫傳感器中需要在免疫復(fù)合物中引入合適的標(biāo)記來形成電化學(xué)反應(yīng)。在這方面，標(biāo)記酶，包括氧化還原酶、HRP和水解酶AP，由于它們能催化底物生成電活性產(chǎn)物而經(jīng)常被用到，產(chǎn)物的氧化還原電流與待測(cè)物的濃度成正比。

AP催化它的底物4-氨基磷酸苯酯（4-APP）生成4-氨基苯酚（4-AP）。生成的4-AP被氧化成4-醌亞胺（4-QI），從而產(chǎn)生法拉第電流，其大小與待測(cè)物的濃度成正比。值得注意的是，酶標(biāo)記最大的優(yōu)點(diǎn)是，由于催化效果，即使用很少的酶也能得到較大的信號(hào)。1-萘磷酸酯（1-NP）作為底物，用于電流型免疫傳感器檢測(cè)黃體酮。水解產(chǎn)物4-AP和1-萘酚能夠在裸SPCE上產(chǎn)生完美的陽極信號(hào)。然而，當(dāng)電極表面固定上抗體時(shí)會(huì)減慢4-AP向電極表面的擴(kuò)散，并且4-AP會(huì)與電極表面的聚酚發(fā)生反應(yīng)，污染電極，減小電極的電活性工作面積。相反，抗體的固定卻不會(huì)阻礙1-萘酚向電極表面的擴(kuò)散。由于1-NP的這種性質(zhì)，以及低成本、易得到、高溶解性使得1-NP成為他們工作中首選的AP底物。在同樣條件下，2-磷酸抗壞血酸（AAP）作為另一種AP底物，水解產(chǎn)物也是4-AP。雖然4-APP和AAP均可作為電流型免疫傳感器的底物，由于4-APP的催化反應(yīng)速度比AAP高6倍，并且檢測(cè)電位較低（大約200-400mV），通常選用4-APP。值得注意的是，4-APP水解產(chǎn)物特有的較低的檢測(cè)電位可以減少其它物質(zhì)的干擾，提高免疫傳感器的靈敏性。AP常用的底物，包括4-APP、1-NP和磷酸苯酯（PP），它們的水解產(chǎn)物在電極表面均不易擴(kuò)散。非電活性物質(zhì)的聚集導(dǎo)致形成聚合物，并且氧化還原可逆性差，使電極鈍化。電極鈍化反過來影響信號(hào)的重現(xiàn)性及可靠性，降低電流響應(yīng)，在達(dá)到穩(wěn)定的電流信號(hào)前信號(hào)猝滅。最近發(fā)現(xiàn)了一種較新的底物，氫醌二磷酸酯（HQDP），來減少污染的問題。HQDP被AP水解生成對(duì)苯二酚（HQ），HQ在電極表面被氧化成苯醌（BQ）。通過對(duì)AP催化水解HQDP（HQ）、PP和1-NP產(chǎn)物的循環(huán)伏安圖比較研究表明，HQ產(chǎn)生的峰形較好，且可逆。更重要的是，即使在較高的mM濃度下，循環(huán)掃50次后仍未發(fā)現(xiàn)明顯的電極污染。通過系列的研究表明，HQ的無污染性歸因于它的氧化產(chǎn)物不在電極表面聚集，以及HQ在電極-溶液界面良好的擴(kuò)散性。HQDP作為AP底物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，HQ的氧化峰電流比PP或1-NP產(chǎn)物的氧化峰電流高10倍。總之，在電流型免疫傳感器的發(fā)展過程中，HQDP是一種合適的、吸引人的、可供選擇的AP底物。在很多情況下，電流型免疫傳感器的設(shè)計(jì)需要將酶固定在離電極表面較遠(yuǎn)的位置，或者生物樣品中干擾物質(zhì)的存在要求另外的電子轉(zhuǎn)移方式。這就需要用低分子量的氧化還原活性物質(zhì)（即介質(zhì)）在過氧化物酶（通常為HRP或葡萄糖氧化酶）氧化還原中心和工作電極表面之間傳遞電子。介質(zhì)的要求：具有很高的電子轉(zhuǎn)移速率，使過氧化物酶的異相電子轉(zhuǎn)移易于進(jìn)行；具有可逆的異相動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，有較低的再生過電位，在要求的物理?xiàng)l件范圍內(nèi)穩(wěn)定?；贗TO電極檢測(cè)癌胚抗原(CEA)Fig.1SchematicdiagramoftheCEA/Au-chitosan/ITOimmunosensorfordeterminingtheserumCEAlevelbasedonacompetitiveimmunoassay.Fig.2ScanningelectronmicrographsofITOelectrodescoatedwith(a)abareITOelectrodesurface,(b)Au-chitosanand(c)CEA/Au-chitosanmembranes.上面介紹的酶催化信號(hào)產(chǎn)生過程的缺點(diǎn)是一種非直接檢測(cè)技術(shù)。樣品待測(cè)物與其特異性抗體反應(yīng)后如果不洗滌，血清和血漿等生物樣品中存在的AP和其它磷酸酶會(huì)干擾分析結(jié)果。一些HRP底物是致癌物質(zhì)，所以選擇一種安全的底物用于免疫傳感器的常規(guī)操作非常重要這就使得發(fā)展基于電活性物質(zhì)標(biāo)記的更直接的檢測(cè)技術(shù)非常有意義。二茂鐵衍生物是快速、可逆的氧化還原物質(zhì)，可作為介質(zhì)用于酶生物傳感器。其中，二茂鐵甲酸由于其水溶性好，且易通過EDC修飾的末端羧基與IgG結(jié)合，經(jīng)常被用到。施加合適的電壓，二茂鐵甲酸可被快速氧化而不產(chǎn)生任何中間產(chǎn)物。因而二茂鐵甲酸成為一種優(yōu)良的電活性標(biāo)記物，用于與生物組分連接，開發(fā)一種基于信號(hào)直接產(chǎn)生的電化學(xué)免疫傳感器。Hromadova等將有機(jī)金屬化合物三羰基(?5環(huán)戊二烯基)合錳（cymantrene）與BSA結(jié)合，作為氧化還原標(biāo)記物，用電化學(xué)阻抗檢測(cè)有機(jī)金屬標(biāo)記物的一電子還原反應(yīng)。

4.7.3伏安免疫分析

電化學(xué)免疫傳感器通常是將免疫復(fù)合物固定在單根電極上，然后利用免疫復(fù)合物的標(biāo)記物在同一電極上進(jìn)行檢測(cè)。最近，在電化學(xué)免疫分析中采用交叉梳狀陣列（IDA）微電極作為轉(zhuǎn)換器變得比較普遍。簡(jiǎn)單的IDA設(shè)計(jì)包括一對(duì)交叉梳狀的微電極“手指”。當(dāng)IDA用于伏安分析中的傳感電極時(shí)，兩個(gè)相互交叉的梳狀電極通常采用不同的電位使電活性物質(zhì)進(jìn)行氧化還原循環(huán)來檢測(cè)。圖4.164-AP和4-QI在IDA電極體系中相鄰“手指”之間的氧化還原循環(huán)在兩個(gè)IDA電極中的一個(gè)加上氧化電位，使4-AP發(fā)生兩電子氧化反應(yīng)，生成4-QI。另一個(gè)電極上加較負(fù)的電位，4-QI擴(kuò)散到這個(gè)電極上后被還原成4-AP，在下一個(gè)相鄰的電極上又發(fā)生氧化反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)于背景電流來說，法拉第電流被放大，從而提高信噪比，降低檢測(cè)限，提高靈敏度。4-APP4-AP4-QIThomas等利用含有相距1.6μm、2.4μm寬的25對(duì)鉑微電極作為檢測(cè)器，用于免疫分析中檢測(cè)鼠IgG。與單電極檢測(cè)相比，信號(hào)放大了4倍，氧化還原信號(hào)產(chǎn)生率為87%，鼠IgG的檢測(cè)限為3.5fmol。4.7.4阻抗免疫分析及免疫傳感器

在4.4節(jié)介紹了抗體在電極表面不同的固定方法，這是在電化學(xué)免疫傳感器表面構(gòu)筑理想的免疫復(fù)合物的第一步。通過抗體與抗原之間的特異性分子識(shí)別，免疫傳感器表面的界面電荷、電容、電阻、質(zhì)量以及厚度都會(huì)發(fā)生變化。這就激發(fā)了人們的興趣，根據(jù)這些界面變化尋求電化學(xué)技術(shù)，以定量檢測(cè)待測(cè)物。本節(jié)重點(diǎn)討論電化學(xué)阻抗譜（EIS），它是一種有效的方法用以檢測(cè)免疫復(fù)合物修飾電極的性質(zhì)。EIS實(shí)驗(yàn)中，在電化學(xué)體系中固定的直流電位上施加一個(gè)小幅（5~10mV峰間距）正弦波電位信號(hào)。根據(jù)Ohm定律，通過施加的正弦電位和檢測(cè)到的正弦電流可以繪制阻抗譜。由于正弦電位和電流無論在大小和相等方面均不同，它們的合成阻抗，Ｚ，對(duì)頻率（ω）的函數(shù)通常用實(shí)部（ZRe）和虛部（ZIm）來表示：圖4.17電化學(xué)免疫傳感器發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)界面性質(zhì)的等效電路圖

其中RS指電解質(zhì)溶液電阻，CdI指雙電層電容，Ret指電解質(zhì)溶液發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的電荷（或電子）轉(zhuǎn)移阻抗，Zω指大量離子從電解質(zhì)中運(yùn)動(dòng)到電極表面產(chǎn)生的Warburg阻抗。RS和Zω代表溶液的性質(zhì)，不受免疫復(fù)合物在電極表面修飾的影響。CdI和Ret的大小則由電極-電解質(zhì)界面介電性質(zhì)和絕緣性質(zhì)決定。對(duì)于固定了免疫復(fù)合物的電極表面來說，雙電層電容包括裸電極的恒定電容（Cbare）和免疫復(fù)合物產(chǎn)生的可變電容(Cimmun)，用方程（4）來表示。(4)免疫復(fù)合物通常都是非電活性的，它們覆蓋在電極表面會(huì)降低雙電層電容，阻礙電解質(zhì)溶液中氧化還原探針的界面電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)。因此，Ret也可看成是裸電極的恒定電阻（Rbare）和免疫復(fù)合物修飾電極后變化的電阻（Rimmun）的和：Ret=Rbare+Rimmun