寄生蟲疫苗研究進展

寄生蟲疫苗研究進展

疫苗是控制和消除感染疾病的有效手段。寄生蟲疫苗研究始于1903年，至今已有100多年歷史。在低毒活疫苗、致弱活疫苗、滅活或死病原疫苗、亞單位疫苗（包括抽提物或代謝產(chǎn)物）、合成的和重組抗原疫苗、抗獨特型疫苗和DNA疫苗等方面做了大量的實驗研究，有的進行了現(xiàn)場驗證。雖有證據(jù)表明幾乎全部寄生蟲感染后宿主存在獲得性免疫或對再感染的抵抗力，但寄生蟲抗原免疫所誘導的大多為部分保護性免疫力（一般為30%～70%），很難像病毒和細菌抗原那樣誘導出99%或99.9%的保護性免疫力。究其原因，主要與以下方面有關：多數(shù)寄生蟲為復細胞生物，或生活史較復雜；抗原成分不僅存在種特異性，又有發(fā)育各階段的特異性或差異性；抗原所誘導的保護性免疫應答機制尚不清楚；寄生蟲存在逃避宿主免疫應答的現(xiàn)象，其機制尚待闡明；寄生蟲一般引起宿主慢性長期感染。成功的寄生蟲疫苗可能由多個特異性抗原（或表位）組成，所產(chǎn)生的保護性免疫力需要針對生活史中一個以上的感染階段。1寄生蟲疫苗的研究1.1研制有效的代被疫苗瘧疾是當今世界上最嚴重的三大傳染病之一。隨著瘧原蟲抗藥性蟲株的出現(xiàn)、對殺蟲劑抗性蚊的擴散、人口流動特別是對瘧疾無免疫力人口的遷移等，使瘧疾仍在世界較大范圍流行，研制有效的瘧疾疫苗是控制瘧疾發(fā)病率和死亡率的首選目標之一。瘧疾疫苗的研究主要集中于紅前期疫苗、紅內期疫苗和傳播阻斷疫苗。1.1.1免疫可誘導的免疫藥物的應用理想的疫苗應能同時誘導體液免疫和CD8+T淋巴細胞介導的細胞免疫，以阻止子孢子侵入宿主肝細胞或清除被瘧原蟲寄生的肝細胞?？棺渔咦右呙缋碚撋媳仨毦邆?00%有效才有實用價值，因為單個子孢子感染就能導致嚴重血液期（紅內期）感染，不過降低紅前期的感染率可降低瘧疾的發(fā)病率和死亡率。針對紅前期的數(shù)種疫苗已進行人體試驗評估。這些疫苗是根據(jù)以往小鼠瘧疾模型的研究，證明以照射致弱子孢子免疫小鼠可產(chǎn)生對子孢子攻擊感染完全抵抗力而設計的。紅前期疫苗候選抗原包括環(huán)子孢子蛋白（CSP）、血凝素相關黏附蛋白（TRAP）或稱環(huán)子孢子蛋白2(SSP2）、肝期抗原1和3(LSA1和LSA3）、輸出蛋白1(EXP1）等。CSP具有多個T、B細胞表位，能夠誘導細胞免疫和體液免疫雙重應答，是感染阻斷疫苗最主要的候選抗原之一。大多數(shù)研究者采用重組或合成CSP來研究其免疫力，因為該蛋白是子孢子表面的主要蛋白，與子孢子在蚊血腔中向唾液腺移行、入侵哺乳動物宿主等有關。CSP包括中央的NANP四肽重復序列區(qū)和兩端的側翼序列區(qū)，該蛋白免疫所誘導的特異性抗體針對中央重復序列區(qū)，可能受人白細胞抗原HLAII類分子調控；側翼序列區(qū)只有很少的B細胞表位，而T細胞表位主要分布于側翼序列區(qū)。用惡性瘧原蟲（Plasmodiumfalciparum,Pf）重組蛋白及CSP有免疫活性的B細胞表位合成的多肽，加破傷風毒素(tetanustoxoid)作為載體進行有限的人體試驗，結果并不理想，僅少數(shù)試驗對象產(chǎn)生保護性。用CSP結合能加強免疫應答的佐劑制成抗原制劑則顯示較好的免疫效果，其中一種抗原制劑配方為CSP和乙型病毒性肝炎表面抗原（HBsAg）以油-水均化制成，再加免疫激活佐劑(monophosphoryl-lipidA和QS21)，這種疫苗在大多數(shù)受試者產(chǎn)生對瘧疾感染完全抵抗力及高水平抗子孢子抗體滴度，提示有一種與體液免疫相關的保護性作用。開展臨床試驗進展較快的疫苗有RTS,S/AS02A，由Pf3D7株CSP之207～395氨基酸編碼基因與HBsAg(226個氨基酸構成疫苗的S部分）氨基端基因融合構成的，RTS和S基因同時表達的多肽自發(fā)形成RTS,S顆粒。RTS,S與AS02A佐劑免疫能誘導出高水平的針對CSP和HBsAg的抗體反應；同時誘導以γ-干擾素（IFN-γ）產(chǎn)生為特征的Th1型細胞反應，這被認為是臨床試驗有效性的成分。多次研究證實其在人體是安全的，有較強的免疫原性，而且與AS02A佐劑聯(lián)用取得最好的免疫效果。在岡比亞成人進行有效性試驗，在15周的監(jiān)測期間，疫苗有效率為34%，但前9周和后6周的有效率分別為71%和0，表明持效性不長，但作為具有抗惡性瘧自然感染作用的紅前期疫苗，值得深入開展臨床試驗。在岡比亞開展了6～11歲兒童的I期臨床試驗，具有很好的安全性和耐受性，已在1～5歲幼兒進一步進行安全性試驗。RTS,S+TRAP/AS02A疫苗對成人、成年恒河猴和幼猴安全并有較好的免疫原性。ICC-1132疫苗包括CSP的3個NANP重復序列和NVDP變異序列、以及廣譜性T細胞表位CSP326～345，編碼基因插入HBsAg，表達的蛋白自行組裝成病毒樣顆粒，誘發(fā)高效的特異性抗體，同樣有很好的安全性和耐受性。取得類似效果的還有Pf的CSP282～383合成多肽疫苗，而CSPDNA疫苗僅在大多數(shù)人體誘導特異的細胞毒T細胞應答和CD8+ELISPOT應答，抗體應答則很弱。1.1.2融合蛋白的免疫作用紅內期疫苗是針對人體內增殖的紅內期瘧原蟲，主要包括抗體依賴的和細胞介導（非抗體依賴）的兩類免疫。此外，抗體依賴的細胞抑制作用（ADCI）可起到控制原蟲密度作用，且為非蟲株特異的。多個瘧原蟲紅內期階段抗原能誘導ADCI，如裂殖子表面蛋白3(MSP3）、絲氨酸富含抗原（SER-A）和谷氨酸富含蛋白（GLURP）。對Pf，抗紅內期抗體可發(fā)揮主要保護作用。由于紅內期瘧原蟲大部分時間寄生在紅細胞內，只有較短暫的時間以裂殖子形式游離于宿主的血液中，裂殖子才真正成為免疫抗體的靶標，因此，MSP和頂端復合體抗原成為該類疫苗的熱點。紅細胞內期疫苗的主要候選抗原包括MSP1、MSP2、MSP3、GLURP、SERA、紅細胞結合抗原（EBA-175）、環(huán)狀體感染紅細胞表面抗原（RESA）和頂端膜抗原1(AMA1）等。Pf的3D7株和FVO株兩種MSP1-42重組蛋白經(jīng)重折疊成的正確構象，免疫家兔獲得的抗血清在體外有抑制作用。3D7株MSP1-42蛋白與AS02A佐劑免疫動物誘導出高抗體應答，能在體外抑制瘧原蟲入侵紅細胞，而該蛋白在肯尼亞瘧疾流行區(qū)1～4歲兒童的I期臨床試驗顯示出很好的安全性和免疫原性。AMA1也是重要的疫苗候選抗原，動物AMA1免疫后可誘導很好的保護作用，Pf的AMA1蛋白免疫家兔血清、自然感染者血清中提取的特異性抗體和抗AMA1第三區(qū)域的抗體具有在體外抑制瘧原蟲入侵紅細胞的作用。3D7株的AMA1胞外區(qū)蛋白重組蛋白經(jīng)折疊后與佐劑（MontanideISA720）乳化，進行I期臨床試驗有很好的安全性，但未獲得很高的免疫應答；該重組蛋白與AS02A佐劑也將進行臨床試驗。用畢氏酵母表達Pf3D7和FVO株兩種序列的AMA1蛋白聯(lián)合免疫家兔獲得的抗血清未發(fā)現(xiàn)其間有拮抗作用，對兩株瘧原蟲都有很好的抑制作用，聯(lián)合應用免疫計劃將進行臨床試驗。MSP3多肽（各有3個B和T細胞表位）能誘導ADCI作用，抗體以IgG1和IgG3為主。臨床試驗顯示鋁佐劑和MontanideISA720均能在志愿者體內誘導起ADCI作用的IgG抗體應答。針對瘧原蟲抗原的變異性，采用多個候選抗原可能更有效，如將3個瘧原蟲紅內期蛋白RESA、MSP2和MSP1(190.T3）與MontanideISA720佐劑進行臨床試驗顯示無明顯不良反應,并能顯著降低原蟲密度。構建融合蛋白可消除或降低多個蛋白伍用可能產(chǎn)生的相互拮抗，如SPf66候選疫苗是由瘧原蟲不同發(fā)育階段抗原的線性表位融合而成；PfCP-2.9由3D7株AMA1第三區(qū)基因與MSP1-19(Q-KNG型）基因連接而成，在畢氏酵母中表達，融合蛋白較單獨表達產(chǎn)物更接近其天然構象，免疫血清有很高的效價，已進入臨床試驗。1.1.3pvs30/28在次重復免疫后細胞蛋白免疫疫苗的應用基于阻斷瘧原蟲在蚊體內發(fā)育的傳播阻斷疫苗的研究表明，體液免疫對瘧原蟲在蚊體內發(fā)育階段起著重要的傳播阻斷作用，表現(xiàn)在干擾雌雄配子受精、阻斷動合子穿入蚊胃壁和向卵囊轉化以及阻遏子孢子在按蚊唾液腺的發(fā)育。由于針對瘧原蟲有性階段抗原的抗體對人群本身不能起到預防和保護作用，所以這類疫苗不像上述兩類疫苗備受關注和重視。Pvs25/28是間日瘧原蟲合子和動合子表面蛋白，重組蛋白能誘導小鼠產(chǎn)生很強的抗體應答，降低瘧原蟲對蚊的感染力和阻止卵囊的形成，Pvs25較Pvs28為更理想的傳播阻斷疫苗抗原。Pvs25/28DNA疫苗在動物和人體試驗顯示了良好的免疫效果，有開發(fā)和應用前景。Pfs25/28抗體有協(xié)同的傳播阻斷效應，Pf配子體蛋白抗原Pfs25（在酵母中表達）在小鼠、家兔和靈長類動物均能誘導特異性抗體應答，膜飼試驗顯示能有效阻斷傳播，目前擬開展I期臨床試驗。1.2日本血吸蟲疫苗在國外，曼氏血吸蟲（Sm）和埃及血吸蟲（Sh）基因工程疫苗研究獲得了顯著進展，令人鼓舞。美國和埃及政府聯(lián)合資助的血吸蟲疫苗研究計劃（SVDP）以及法國巴斯德研究所共同在非洲血吸蟲病現(xiàn)場，進行重組曼氏或埃及血吸蟲谷胱甘肽S-轉移酶（Sm28000GST）、副肌球蛋白（paramyosin）和磷酸丙糖異構酶（TPI）等人體I期和II期臨床試驗，取得不同程度進展。從生物學角度和疫苗研究實際情況看，免疫發(fā)病機制與曼氏和埃及血吸蟲病明顯不同的日本血吸蟲病，疫苗的研制難度大于前兩種血吸蟲，但近幾年來，曼氏血吸蟲研究得到的疫苗候選抗原，在日本血吸蟲也已研究獲得，并應用純化抗原和重組抗原進行動物試驗，取得了確切的保護性效果。對中國、澳大利亞和菲律賓聯(lián)合開展的有關日本血吸蟲天然抵抗力的流行病學和實驗室研究資料表明，易感動物和人群感染日本血吸蟲后能產(chǎn)生獲得性免疫力即對再感染的抵抗力或“伴隨免疫”。這一研究進展給日本血吸蟲病疫苗的研制提供了強有力的依據(jù)，同時增強了科學家對疫苗研制的信心。迄今為止，免疫效果最好的血吸蟲病疫苗仍然是照射致弱疫苗，在非人靈長動物（如西非狒狒屬Papioanubis）免疫后可誘導出對正常尾蚴的攻擊感染50%以上的保護性。但致弱尾蚴制備周期長、得量少、壽命短、貯運不便，且有潛在感染的危險，而且該制劑抗原成分復雜，也可能導致非期望出現(xiàn)的免疫病理學或是免疫抑制后果，因此，必須鑒定出血吸蟲特異的和疫苗有關的特定抗原分子。近年來，通過應用分子生物學和免疫學等方法對血吸蟲候選疫苗分子進行了大量實驗研究，確定了一些較有希望的候選疫苗分子，并采用基因重組技術制備大量的重組抗原（基因工程疫苗）。根據(jù)篩選和鑒別候選抗原所用方法可將抗原分子分為3類，采用照射等致弱尾蚴模型選擇候選抗原，采用保護性單克隆抗體鑒別靶抗原，或從人群研究著手，發(fā)現(xiàn)或鑒定出天然具有較強抵抗力的人群（EN人群）的免疫系統(tǒng)所識別的獨特抗原。血吸蟲疫苗近年來最明顯的進展在候選抗原及其編碼基因的克隆和表達方面。WHO曾推薦曼氏血吸蟲6個疫苗候選分子，包括GST(Mr28000）和TPI2種酶、副肌球蛋白和肌球蛋白2種肌肉結構蛋白、—Sm23和Sm142種膜抗原。其中GST被認為是最有希望在人體試用的候選疫苗。在我國只有日本血吸蟲病流行。近年來，日本血吸蟲疫苗候選抗原的研究取得了較大的進展，獲得的疫苗候選抗原分子遠不止以上幾種，分述如下。1.2.1resjcgst的免疫機制GST是血吸蟲生理功能所需要的重要解毒酶，對蟲體正常生理功能起著重要作用。作者所在課題組在20世紀80年代中期首先用親和層析等方法，成功地從血吸蟲（大陸株）分離純化了上述兩種天然的GST(Sj26GST和Sj28GST），并對其抗原性及免疫原性進行研究，證明Mr26000蛋白（Sj26GST）具免疫原性。在對其編碼基因進行了克隆和高效表達后，應用重組Sj26000(reSjcGST）抗原免疫小鼠能夠誘導對攻擊感染明顯的抗感染和抗生殖免疫作用（減蟲率20%～32%，減卵率57.1%～79.9%）。繼而以鋁作為佐劑免疫豬，攻擊感染后發(fā)現(xiàn)減卵率達54%，而成熟蟲卵減卵率則高達72%。牛是我國血吸蟲病傳播的重要宿主，重組抗原免疫水牛，攻擊感染后糞便蟲卵大幅減少，肝、脾、腸粘膜的蟲卵數(shù)均顯著下降。免疫黃牛也獲相似的保護力，減蟲率為30%，而肝臟減卵率達到60%。對reSjcGST免疫機制的研究也取得了進展，電鏡觀察，重組抗原免疫的小鼠，攻擊感染后發(fā)育的成蟲卵黃腺和睪丸明顯退化，卵黃細胞內卵黃球、卵黃滴及內質網(wǎng)、核糖體和脂滴的數(shù)量大為減少，使蟲卵的形成和血吸蟲生殖生理受到損害，表現(xiàn)為抗生殖作用。reSjc26GST免疫小鼠后特異性抗體IgG及IgG1、IgG2a與IgG2b亞類升高，并能誘生Th1型應答的因子[白細胞介素2(IL-2）及IFN-γ]和Th2型應答的因子（IL-5），表明該重組抗原免疫后同時誘生細胞免疫應答和體液免疫應答。reSjc26`GST免疫家兔和黃牛的免疫持效觀察，在兔體內特異性抗體至少可持續(xù)65周，黃牛免疫1年后攻擊感染，仍具有較高的保護作用，為制定有效的免疫方案打下基礎。磷酸丙糖異構酶（TPI）是糖酵解中的一個關鍵酶，血吸蟲糖代謝非常活躍。作者課題組在證明血吸蟲天然TPI具有一定的免疫原性后，成功克隆了該分子全長cDNA，并在大腸埃希菌中高效表達（1L工程菌培養(yǎng)液可獲13mg純重組日本血吸蟲TPI蛋白），在非變性條件下純化的重組蛋白（蟲源）具有的酶活力高達7687U/mg，比商品化的TPI（豬源）活力要高出近一半。制成DNA疫苗加IL-12免疫小鼠，減蟲率和減卵率分別為32.7%和47.0%。體內外試驗表明有一定保護性效果的其他酶分子：成蟲31/32分子（半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶B/天冬酰胺基肽鏈內切酶）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH)、絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins）、鈣離子激活的中性蛋白激酶（calpain)等。從血吸蟲日本Yamanashi株(Sj-J)和中國湖南株(Sj-C)克隆了calpain基因，以DNA疫苗免疫小鼠誘導Th1免疫應答，獲得36.8%的減蟲率、36.3%的減雌蟲率和43.3%的減卵率。近年來新驗證的酶蛋白基因還有很多，大多數(shù)都已獲得了克隆表達，但這些酶蛋白分子能否成為疫苗新候選抗原還有待進一步的研究。1.2.2重組蛋白的檢測副肌球蛋白（paramyosin,PM）是無脊椎動物特有的肌原纖維蛋白質，存在于肌肉和表皮的細長小體中，并不暴露于血吸蟲表面，在蟲體發(fā)育過程中分泌并結合到蟲體表面，成為靶抗原。PM也是人抗血吸蟲感染免疫中IgA應答的主要靶標。日本血吸蟲蟲源與螺（Oncomelaniahupensis）源天然副肌球蛋白免疫小鼠，可使小鼠對攻擊感染產(chǎn)生一定的免疫力（減蟲率分別為26%和34%，減卵率分別為40%和20%）。在成功克隆了全長cDNA，并構建了DNA疫苗（pCMV-SjC97）后，免疫C57BL/6小鼠產(chǎn)生特異的IgM和IgG抗體，其中IgG主要為IgG2a和IgG2b，未檢測到IgG1、IgG3。攻擊感染后減蟲率為35.5%～41.4%，肝、脾、腸組織減卵率分別為44.5%～59.6%、56.7%～82.4%和57.9%，而pCMV-Sjc97DNA疫苗免疫BALB/c小鼠則不能產(chǎn)生保護效果。PM的免疫效果在大動物更明顯，以重組日本血吸蟲PM免疫豬，誘導出高達53%的減蟲率，免疫水牛的減蟲率為42%～45%。其他肌相關蛋白，如肌球蛋白、原肌球蛋白、肌動蛋白基因均已克隆和表達，其重組蛋白進行了動物保護試驗。這些肌肉相關的蛋白可誘導動物產(chǎn)生不同程度的保護力。1.2.3sj23與血吸蟲的聯(lián)合免疫作用Sj23是日本血吸蟲的一種膜蛋白，其DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠誘導部分保護力（減蟲率和減卵率分別為26.9%和22.2%),Sj23與IL-12聯(lián)合應用可提高減蟲率至35.4%。IL-12的這種協(xié)同作用在對豬進行試驗時效果更加顯著，減蟲率由29.2%提高到58.6%。Sj23與血吸蟲其他候選抗原（如SjTPI）聯(lián)合免疫可提高保護力。另外一個引起廣泛關注的蟲膜蛋白為Sj22600膜抗原，人類對日本血吸蟲的抵抗力相關的IgE能識別Sj22600。近年來，有關新的膜蛋白的克隆表達陸續(xù)報道。蟲膜蛋白多暴露于蟲體體表，是宿主對蟲體免疫應答的首要靶標。對蟲膜相關蛋白的研究不僅可以為血吸蟲病疫苗提供候選抗原，也對血吸蟲與宿主相互作用和免疫診斷的研究有著重要意義。1.2.4抗血吸蟲藥物作用包括脂肪酸結合蛋白（FABP）、前述calpain、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)等。FABP是血吸蟲細胞膜中用于吸收、運輸和吞噬宿主體內各種衍生的脂肪酸，在血吸蟲脂肪酸代謝中起著非常重要的作用。血吸蟲不能合成脂肪酸或固醇類物質，但在其重要的代謝過程中需要這些分子，這可能有賴于宿主的提供。日本血吸蟲FABP(SjFABP）為Mr14000的蛋白，不僅是潛在的疫苗候選分子，也是抗血吸蟲藥物作用的主要靶子。SjFABP基因在家蠶細胞及幼蟲中的表達獲得成功。血吸蟲FABP具有良好的抗原性，但SjFABP誘導的保護力不高，僅為20%左右。1.2.5免疫原性分子線粒體在蠕蟲的能量代謝及代謝調節(jié)中起著重要的作用，這些代謝可提供蟲體肌肉活動或神經(jīng)傳導所需的能量，并與維持蟲體生殖功能有關。日本血吸蟲線粒體相關蛋白基因獲得了克隆，重組融合蛋白（rSj338/GST）具有良好的免疫原性，誘導產(chǎn)生抗血吸蟲感染的部分保護力。日本血吸蟲14-3-3蛋白（Sj14-3-3）是一個信號傳導蛋白，主要分布于表皮，肌肉以及成蟲和15d童蟲的實質層中，最初由致弱尾蚴免疫血清篩選基因文庫而發(fā)現(xiàn)。14-3-3蛋白已被確認為血吸蟲病疫苗候選抗原，重組融合蛋白免疫BALB/c小鼠獲得34.2%的減蟲率和50.74%的減卵率。1.2.6克氏原螯蝦克氏原螯蝦對血吸蟲合抱的蛋白組學技術血吸蟲在宿主（人或哺乳動物）體內發(fā)育過程中需要雌雄蟲合抱并可能交換一些物質或信息才能發(fā)育成熟，而且發(fā)育成熟的蟲體仍需要維持合抱狀態(tài)，據(jù)此，能否設計一類疫苗以針對血吸蟲生活史中雌雄蟲合抱階段？本作者課題組與英國York大學合作，應用蛋白質組學技術，對雌雄蟲差異表達蛋白進行了分析鑒定，獲得了一些新的尚未報道的蛋白分子。若找到與血吸蟲雌雄蟲合抱有密切關系的基因或蛋白，明確其保護作用機制，必將大大促進血吸蟲病疫苗的研究和開發(fā)。1.3其他原生昆蟲疫苗1.3.1免疫治療的證據(jù)利什曼原蟲（Leishmaniaspp.）不同種及亞種引起不同類型的利什曼病，分別具有不同的流行病學特征。感染利什曼病后恢復者對再感染有免疫力，提示利什曼病用疫苗接種控制的方法是可行的。利什曼病疫苗可分為組分抗原、經(jīng)遺傳手段轉化的無毒活蟲株、合成和重組抗原、表達利什曼抗原的重組菌/病毒和DNA疫苗，大多數(shù)均處于臨床前期。用死的前鞭毛體作為潛在疫苗進行臨床試驗，以利什曼原蟲4或5個分離株制成的混合疫苗注射受試者，以皮內試驗由陰性轉為陽性作為疫苗接種獲得保護性免疫力的指征，雖在11次接種后皮試陽性率僅為50%左右，但在數(shù)千人中未出現(xiàn)不良反應，為死蟲作疫苗的研究提供了有力的依據(jù)；在巴西已進行抗原混合物疫苗肌肉注射1次作為在巴西預防皮膚利什曼病I期臨床試驗，第1年的保護性為67%～86%，且未見任何重要副作用。在委內瑞拉一種死利什曼原蟲+結核菌苗（BCG）皮內注射對局部皮膚利什曼病提供有效的免疫治療作用。對藥物治療無效的所有病例，用免疫和化學治療相結合的方法幾乎全部治愈，其中也包括有慢性皮膚損害的患者。治療可導致向Th1應答方面的轉變。利什曼病康復的標志為外周血的單核細胞與利什曼原蟲抗原接觸后使IFN-γ的產(chǎn)生和IL-4消失。死利什曼疫苗加BCG進行的I期、II期或III期臨床試驗，雙盲試驗結果在不久的將來也可獲得。已進行的組分抗原臨床試驗結果難以解釋，因為受試組分抗原的制備難以統(tǒng)一，免疫原的分子特征需要進一步鑒定。碩大利什曼原蟲(L.major)經(jīng)基因導向處理成功地制備了一種減毒的二氫葉酸還原酶/肌苷酸合成酶基因缺乏（dhfr-ts-）的蟲株，用敲除了在哺乳類細胞長期生存所必須的dhfr-ts基因而產(chǎn)生的減毒大型利什曼原蟲接種小鼠，可產(chǎn)生針對碩大利什曼原蟲攻擊感染產(chǎn)生抵抗力，且感染的利什曼原蟲不會長期存在于人體及致病，因而作為免疫原是安全有效的。在分子疫苗候選抗原研究方面也取得重大進展，如表面糖蛋白gp63、Lack抗原和蟲體表面抗原2(PSA-2）。其中gp63已進行廣泛而深入的研究，該糖蛋白是迄今為止研究最深入的一種細胞外酶，又稱“主要表面抗原”或“前鞭毛體表面蛋白酶（PSP）”，約占前鞭毛體總蛋白量的1%。這些抗原加佐劑免疫可在實驗動物誘導明顯保護性，但這些佐劑可能不適合應用于人；已找到其他途徑用感染載體如BCG，沙門氏菌和痘苗病毒構建重組BCG表達的利什曼表面抗原Gp63，并證明可誘導小鼠對利什曼原蟲的保護性免疫力。編碼gp63基因還在致弱鼠傷寒沙門氏桿菌表達，并用口服途徑免疫小鼠。gp63DNA疫苗已首先制備成功，能刺激小鼠對利什曼原蟲感染的Th1型保護性免疫應答。其后，還證明LACK抗原基因也能誘導小鼠產(chǎn)生對利什曼原蟲保護性免疫。1.3.2亞單位疫苗弓形蟲全球分布，寄生于人體和動物有核細胞中，能引起人獸共患的弓形蟲病，目前尚無有效治療藥物，疫苗研制非常必要。死疫苗的效果弱，弱毒或減毒活疫苗不適用于人體，近來重組的弓形蟲抗原分子的研究成為熱點，包括亞單位疫苗、復合多價疫苗和核酸疫苗。亞單位疫苗的研究主要在速殖子的主要表面抗原SAGA(P30），是誘導宿主免疫應答的主要靶抗原。此外，SAG2(P22）和SAG3(P43）等也已作為候選疫苗分子進行了研究，但這些抗原基因只在速殖子階段表達。其他發(fā)育階段的候選抗原研究僅處于實驗室研究階段。由于弓形蟲生活史復雜，有多個發(fā)育階段，抗原成分多，因此多種抗原伍用、針對多個發(fā)育階段的多價疫苗是其發(fā)展方向。P30、P22和免疫刺激復合物（ISCOMS）免疫綿羊獲得高水平的抗體應答，不同疫苗候選抗原與霍亂毒素片段、細胞因子、佐劑等的研究也在實驗動物獲得較好的免疫效果。在核酸疫苗方面，SAG1、致密顆?？乖颍℅RA1、GRA4）棒狀體蛋白（ROP1和ROP2）等的單價或多價DNA疫苗研究都顯示出較好的免疫效果。1.4重組基因的誘導免疫作用使用活蟲進行免疫通常比用死蟲或蟲體提取物能誘導更強的保護作用。接種輻射減毒活疫苗的免疫方案效果最好，在絲蟲病、圓線蟲病和鉤蟲病的動物模型中，可達到70%～90%的保護水平。除血吸蟲疫苗有一定的進展外，人絲蟲的多個疫苗候選抗原也得到了鑒定，接種鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)這些重組抗原具有同血吸蟲抗原相似的保護能力，從Ⅲ期幼蟲（L3）的cDNA庫中篩選該階段特異性高豐度轉錄mRNA的基因及其表達產(chǎn)物，認為這種階段特異性高表達產(chǎn)物與絲蟲入侵及入侵宿主后的存活有關。用這種方法篩選到的抗原包括幼蟲高豐度轉錄物（abundantlarvaltranscriptproduct,ALT），研究表明ALT可作為抗馬來絲蟲和盤尾絲蟲感染性幼蟲的保護性候選抗原。用Bm-ALT-1免疫長爪沙鼠，用馬來絲蟲L3攻擊，蟲負荷可下降76%。針對微絲蚴的疫苗具有阻斷絲蟲傳播作用，但不能抗感染性幼蟲的入侵。已篩選到若干個微絲蚴保護性抗原，如與絲蟲表皮及膜相關的幾丁質酶是其保護性單抗的靶點，用此抗原免疫可降低微絲蚴血癥，但不影響宿主體內絲蟲的數(shù)量。盤尾絲蟲的原肌球蛋白也可以誘導出小鼠對微絲蚴的免疫力。也有實驗表明，一種絲蟲體內共生菌Wolbachia抽提的蛋白質作為絲蟲疫苗候選抗原近來也受到重視。研制以阻斷蠕蟲繁殖為目的的疫苗是另一種方案，其效果類似于瘧疾傳播阻斷疫苗，例如接種微絲蚴幾丁質酶，可以阻止微絲蚴從蚊媒的圍食膜逃逸。又如針對涉及血吸蟲交配的受體或干擾血吸蟲產(chǎn)卵的疫苗，具有減少宿主組織病理損害和感染傳播的雙重效果。蠕蟲DNA疫苗可以誘導保護性免疫，是疫苗研究的重要進展。蠕蟲DNA疫苗的研究不僅在血吸蟲，還在許多獸用蠕蟲病疫苗研究上取得了進展。在羊絳蟲（Taeniaovis）蛋白的重組腺病毒疫苗/綿羊、肝片吸蟲（Fasciolahepatica）半胱氨酸蛋白酶DNA疫苗/小鼠、肥頭絳蟲KETc7DNA疫苗/小鼠、豬囊蟲TS76DNA疫苗/小鼠等獸用疫苗實驗研究，多數(shù)是肌肉注射也有用基因槍注射，保護力可高達65%～74%。許多研究者還認為如果先以蠕蟲DNA疫苗載體或質粒DNA免疫，再以重組體免疫，即“prime-boost”免疫方法，所誘導的免疫力水平將會大大提高。盡管蠕蟲疫苗的開發(fā)需解決如選擇佐劑、免疫方案和接種途徑等方面的問題，蠕蟲病的疫苗開發(fā)還面臨許多病毒和細菌疫苗研制中通常不會遇到的問題，如驗證疫苗現(xiàn)場試驗效果的的困難和費用；蠕蟲感染的臨床癥狀通常不嚴重；需考慮疫苗接種宿主-寄生蟲的相互關系，從而導致更嚴重的病理表現(xiàn)。隨著對蠕蟲感染生物學和宿主-寄生蟲相互關系的深入了解，人們對一個成功的疫苗可能遇到的障礙就會有更多的認識，并鑒定出更多的抗原和制定更有效的免疫方案。胃腸道寄生的血矛線蟲對畜牧業(yè)影響較大，常規(guī)驅蟲效果不理想。因此篩選具有誘導保護性免疫反應的疫苗候選抗原至關重要。對捻轉血矛線蟲（Haemonchuscontortus）的功能性抗原及其在綿羊誘導的免疫反應特性進行分析表明，接種捻轉血矛線蟲的低分子抗原（Mr15000/24000），可誘導產(chǎn)生對該蟲的保護性免疫反應，表現(xiàn)為克糞便蟲卵數(shù)（EPG）以及蟲負荷數(shù)降低（EPG降低99%，蟲負荷下降97.6%）。低分子抗原所誘導的保護性免疫反應并非僅為抗體因素，細胞免疫也起重要作用。編碼該抗原基因的克隆表達已完成，正進一步驗證重組產(chǎn)物的疫苗效應。旋毛蟲病是一種世界性分布的人獸共患寄生蟲病，其疫苗的研制對于保障人民身體健康和養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展有重要意義。減毒活疫苗和天然抗原疫苗在動物免疫中取得明顯的免疫效果。候選疫苗排泄分泌抗原Mr43000糖蛋白的30mer合成多肽抗原與CT-B一起經(jīng)鼻腔免疫小鼠產(chǎn)生特異性血清IgG1、腸道IgA和Th2細胞因子為主的免疫應答。兩種幼蟲TspE1和λTs39基因表達的重組抗原免疫小鼠均誘導明顯的保護作用。Ts87和TspE1等DNA疫苗均能誘導小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應答。應用棘球蚴病疫苗預防中間宿主的感染是切實可行的控制措施。通常給幼畜隔月注射疫苗，疫苗分子來源于羊細粒棘球絳蟲的六鉤蚴。近年來發(fā)現(xiàn)2～3日齡六鉤蚴的微絨毛層可以發(fā)育成續(xù)絳期幼蟲的表皮。前者可刺激機體產(chǎn)生很強的保護性抗體反應。隨著續(xù)絳期的發(fā)育，伴隨免疫產(chǎn)生，繼而侵入的六鉤蚴被抗體依賴補體反應溶解、殺死。動物在接種六鉤蚴的分泌物及六鉤蚴勻漿后，可獲得對攻擊感染99%的保護力。經(jīng)鑒定這些抗原的主要成分為Mr25000蛋白。用抗Mr25000蛋白抗體篩選六鉤蚴cDNA文庫，最后經(jīng)大腸埃希菌克隆、表達出的產(chǎn)物不加佐劑用于羊保護性免疫試驗，其中的一株克隆Eg95可誘導96%的保護力。Eg95DNA疫苗成本低，免疫保護作用持續(xù)時間長，已成功地應用于羊絳蟲病的預防，為該病的防治展現(xiàn)了新的前景。鉤蟲病對人類的危害性及其科學研究價值越來越明顯。研究者們轉變了“只要世界各國生活水平提高，穿鞋，鉤蟲病就會自然消失”的模糊概念，面對世界范圍內仍有12億以上鉤蟲感染者，而且鉤蟲感染人群中已出現(xiàn)對苯丙咪唑類驅蟲藥的耐藥性，以及鉤蟲感染宿主存在明顯的免疫抑制等現(xiàn)象，又重新重視鉤蟲疫苗的研制，但免疫后不能誘導出有效的對再感染的抵抗力而缺乏應用價值。犬鉤蟲的L3分泌抗原（Ancylostomasecretedprotein,ASP）為ASP-1和ASP-2兩種富余半胱氨酸的分泌蛋白，是犬鉤蟲從自由生活階段向寄生階段過渡時分泌的主要蛋白。通過大量研究，已證明ASP是具有前景的鉤蟲疫苗的后選抗原。犬鉤蟲ASP-1已克隆和表達，其重組蛋白免疫犬再以犬鉤蟲幼蟲攻擊感染時，未見產(chǎn)生速發(fā)型變態(tài)反應，與對照組相比腸道鉤蟲數(shù)減少，雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)降低，表明此疫苗有可能阻斷鉤蟲的傳播。重組ASP-1免疫小鼠后，產(chǎn)生特異性抗體，對攻擊感染的減蟲率可高達79%。我國研究者還證明重組ASP-1抗體與犬鉤蟲感染期幼蟲抗原產(chǎn)生的免疫反應有種、期特異性。且ASP-1免疫誘導的保護性與活的L3免疫誘導的保護性機制不同，前者主要是Th2體液免疫相關，而L3誘導保護性與細胞免疫有關。目前，ASP-1的真核高效表達及DNA疫苗的研究正在進行中。犬鉤蟲成蟲ES抗原中包含的一些蛋白酶分子以及其他功能分子如嗜中性抑制因子（NIF）、抗凝血肽(AcAp)、副肌球蛋白（PM）等，有的已克隆表達，但是否能作為鉤蟲疫苗的候選抗原，尚待驗證。2最佳確定的疫苗選擇標準寄生蟲疫苗的成功研制依賴于對寄生蟲感染時所引起免疫應答的細胞和體液成分清楚的了解，以及對能誘導保護性應答抗原的確定。近年來在驗證某些重要寄生蟲病疫苗候選抗原及其編碼基因的克隆和表達方面取得了明顯進展，但對免疫宿主所誘導保護性免疫力的機制的了解以及人對寄生蟲免疫應答特征的研究還進展不大。對利什曼原蟲感染的抵抗力依賴于Th1應答，所產(chǎn)生IFN-γ激活巨噬細胞殺死細胞內原蟲。也可能與抗體產(chǎn)生有關，特別是內臟利什曼病。為此，利什曼病的免疫機制需進一步闡明。瘧疾免疫機制也不甚清楚，但抗體應答限制子孢子入侵肝細胞，并在蚊體內對有性期的清除起作用。細胞免疫機制可能在肝內起作用，但并不完全有效。各種抗體和非抗體參與的機制均參與紅細胞內期的免疫應答。從瘧疾疫苗研制反復受挫，其中比較突出的問題可能就是瘧原蟲保護性抗原受到主要組織相容性復合物（MHC）的限制作用，從而削弱了其免疫原性。已有許多報道證明MHC與瘧疾疫苗幾種主要候選抗原間（如環(huán)子孢子抗原CSP，環(huán)狀體感染紅細胞表面抗原RESA，裂殖子表面蛋白抗原MSA，雜合多價抗原SPf66，肝期特異性抗原LSA-1，配子期抗原等）的識別與限制作用直接影響到這些抗原的免疫應答水平，所以瘧疾疫苗的研究中應十分重視MHC的限制作用。在現(xiàn)有抗原設計中已考慮上述限制作用，并采用與某些T細胞表位相連如與Th-2R、IL-1、IL-2、破傷風類毒素TT等相連，這些外來表位有可能以某種方式克服存在于非效應細胞上的免疫反應的基因限制，使疫苗的免疫效果得到增強。為此，如何設計出一種可被大多數(shù)MHC分子識別，但又不受其明顯限制的疫苗候選抗原，將仍是今后瘧疾疫苗研究的重要方面。血吸蟲作為一種細胞外寄生性蠕蟲，其免疫機制中Th2應答占優(yōu)，但問題在于是否這些免疫應答與宿主抵抗力有關。在人血吸蟲病，流行區(qū)年紀較大的患者因反復感染產(chǎn)生明顯的對再感染的保護作用。高水平的特異性IgE已證明與對再感染抵抗力有關。而IgG4似乎為封閉抗體。此外，在鼠模型，抵抗力依賴CD4+T淋巴細胞，Th2應答在鼠模中