水通道蛋白4在大鼠腦膜炎腦水腫模型中的表達及內化作用

水通道蛋白4在大鼠腦膜炎腦水腫模型中的表達及內化作用

細菌腦膜（bacurose）是兒童中樞神經系統(tǒng)的一種常見感染疾病。炎癥引起的腦水腫可導致神經細胞損傷和顱內壓增高,危害嚴重。但是,腦膜炎患者中腦水腫的發(fā)生機制并不十分清楚。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)的發(fā)現(xiàn)為研究腦水腫的發(fā)生機制開辟了新領域。AQPs成員中,水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)在腦內表達最豐富,它是一種靜水壓和滲透壓依賴的雙向水通道膜蛋白,呈極性分布于星形膠質細胞在微血管周圍形成的細胞終足膜上和在軟腦膜內表面形成的膠質界膜上,以及室管膜細胞的基底部等部位。有研究發(fā)現(xiàn),在肺炎鏈球菌所致的小鼠腦膜炎腦水腫模型中,腦內AQP4表達增高,提示AQP4的表達變化與小鼠腦膜炎腦水腫的發(fā)生存在一定關系。內化(internalization)是指在某些生理或病理條件下,細胞的部分胞膜、跨膜蛋白以及受體或受體-配體復合物等通過胞吞、胞飲作用進入胞內的過程。有研究表明,在生理和病理情況下,很多細胞膜上的通道蛋白可發(fā)生內化,以調節(jié)其轉運功能。那么,在大鼠腦膜炎模型中,是否也存在AQP4內化的現(xiàn)象呢?為探討在大鼠腦膜炎的病程中,AQP4在腦水腫發(fā)生中的作用,本研究觀察幼年大鼠細菌性腦膜炎模型腦內AQP4的表達變化以及是否存在AQP4內化的現(xiàn)象。1材料和方法1.1設感染劑及試劑B族溶血性鏈球菌(groupBhemolyticstreptococcus,GBS)菌株由重慶醫(yī)科大學病原微生物和免疫學實驗室提供,小鼠抗AQP4單克隆抗體、兔抗早期內涵體1(earlyendosomeantigen1,EEA1)多克隆抗體、小鼠抗甘露糖-6-磷酸受體(mannose-6-phosphatereceptors,MPR)單克隆抗體購自Abcam,兔抗AQP4多克隆抗體購自SantaCruz,小鼠抗β-actin一抗購自北京中杉,相應熒光二抗購自康為世紀、碧云天及北京中杉,蛋白裂解液、BCA試劑盒、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天,羊抗小鼠Western二抗購自Bio-Rad公司,其他均為國產分析純。1.2早期感染型B族溶血性鏈球菌菌株接種于血瓊脂糖培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜,移種至血清肉湯培養(yǎng)基,生長至對數(shù)生長中期收菌,生理鹽水沖洗2次。紫外分光光度儀檢測菌液的濁度,調整菌液濃度為108CFU/L。1.3嘴唇型嘴唇模型的誘導3周齡SD大鼠34只(體質量約50g,雌雄不限,購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心),分為2組:生理鹽水(n=18)對照組和實驗組(細菌感染組,n=16)。腦膜炎模型的誘導參照文獻的方法。3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,小腦延髓池穿刺進針,回抽50μL腦脊液(CSF)棄去,實驗組注入GBS菌懸液50μL,生理鹽水組注入50μL無菌生理鹽水。術后置籠于室溫23℃,觀察臨床表現(xiàn)。1.4腦含水量測定接種細菌24h后迅速取腦稱量濕質量,95℃真空干燥箱烤干至恒重,稱量得干質量,按以下公式計算腦含水量:BWC=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。1.5腦酰胺的提取幼鼠在處死前2h經頸外靜脈注射2%伊文思藍(EB)溶液(20mL/kg),2h后經心灌注生理鹽水沖洗.處死后迅速取腦,按3mL/100mg腦組織加入甲酰胺,37℃恒溫水浴箱避光提取72h。提取液用N725型分光光度計(波長620nm)測其光密度值[D(620)],用倍比稀釋法制作標準曲線,再求得腦組織EB含量。1.6小鼠抗aqp4的表達接種細菌24h后左心室灌注0.9%生理鹽水沖洗,迅速取腦,分離大腦皮質,細胞裂解液提取蛋白;BCA法測定蛋白濃度,調節(jié)蛋白濃度一致,取等量蛋白樣品(30μg),SDS電泳分離蛋白,濕轉將蛋白條帶轉移至PVDF膜上。Western封閉液封閉1h;1∶500小鼠抗AQP4單克隆抗體4℃過夜,1∶3000HRP標記的羊抗小鼠IgG37℃孵育1h;1∶1000小鼠抗β-actin單克隆抗體4℃過夜,1∶3000HRP標記的羊抗小鼠IgG37℃孵育1h;DAB顯色。應用QuantityOne軟件半定量分析,結果以AQP4和β-actin的比值表示。1.7傳統(tǒng)he染色、免疫熒光檢測接種細菌24h后用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,左心室灌注0.9%生理鹽水沖洗,4%多聚甲醛灌流固定,取全腦,4%多聚甲醛固定過夜,30%蔗糖脫水至沉底,冰凍切片連續(xù)冠狀切片。HE染色:常規(guī)HE染色。免疫熒光檢測:PBS漂洗,0.3%TritonX-100作用30min,0.1%BSA37℃封閉90min,適當稀釋的一抗混合液4℃過夜,PBS漂洗,相應的二抗37℃孵育90min,PBS漂洗,5%DAPI-甲醇溶液孵育5min,PBS漂洗,50%甘油封片。空白對照采用0.1%BSA代替一抗孵育。激光共焦顯微鏡(LSM510Meta,Zeiss,Oberkochen,Germany)下觀察皮質部分并拍照。1.8統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析。對實驗數(shù)據(jù)進行兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。2結果2.1幼鼠感染24h后he染色表現(xiàn)實驗組幼鼠接種細菌24h后,2只死亡,其余16只輕者表現(xiàn)為精神差,進食少,運動減少,重者表現(xiàn)為反應遲鈍、嗜睡,體溫低等體征;對照組幼鼠無上述表現(xiàn)。實驗組感染24h后HE染色見腦膜增厚及大量炎性細胞浸潤;對照組細胞排列整齊,形態(tài)規(guī)則,未見炎性細胞浸潤(圖1)。2.2腦含水量測量的結果對照組和實驗組腦含水量分別為(77.3±1.6)%、(81.4±2.3)%,實驗組較對照組明顯增高(P<0.05)。2.3兩組間2.33、4.330.330.320.213.213.213.213.213.213.320.320.320.213.213.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.213.2135.213.213.213.213.4.323.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.320.323510.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.21310.323.323.323.323.323.323.323.323.323.323.323.21310.21310.213.21310.21310.213.213.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.327.32對照組和實驗組EB含量分別為(4.27±0.33)、(4.35±0.21)μg/g,兩組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。2.4組患者7.0的比較實驗組AQP4表達量(57.41±7.0)%較對照組(44.49±7.45)%增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。2.5pr表達微觀表達對照組大腦皮質中早期內涵體標記物EEA1及晚期內涵體標記物MPR表達微弱,未見明顯AQP4與EEA1或AQP4與MPR的共表達;實驗組大腦皮質中EEA1及MPR表達增多,同時AQP4分別與EEA1和MPR共表達比例增多(圖3,表1)。3細胞毒性腦水腫的功能本研究用GBS注入幼鼠延髓小腦池,實驗組幼鼠出現(xiàn)腦膜炎癥狀,HE染色顯示腦膜及腦實質有炎性細胞浸潤,同時腦水含量較對照組增加。因此,我們成功地用GBS誘導出幼鼠細菌性腦膜炎腦水腫模型。腦水腫按發(fā)生機制主要分為細胞毒性水腫(cytotoxicedema)和血管源性水腫(cytotoxicedema)兩類。本實驗中血腦屏障通透性的檢測結果顯示實驗組和對照組EB含量無統(tǒng)計學差異,提示在GBS接種24h后誘導的細菌性腦膜炎的模型中腦水腫的類型以血腦屏障保持完整為特點的細胞毒性水腫為主。這一結論被Papadopoulos等通過電鏡觀察所證實,他們發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌感染36h后形成的小鼠腦膜炎腦內呈現(xiàn)典型的細胞毒性腦水腫的形態(tài)特征:膠質細胞腫脹,血腦屏障完整。有研究發(fā)現(xiàn)AQP4在不同類型的腦水腫的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用不同:在細胞毒性腦水腫的發(fā)生過程中,AQP4表達增高,可促進水分進入細胞內,加重細胞水腫;在血管源性的腦水腫中,AQP4則有利于細胞間隙多余水分的清除。本實驗在腦膜炎腦水腫的發(fā)生、發(fā)展中,AQP4的表達較對照組增高。文獻認為,在細胞毒性腦水腫發(fā)生、發(fā)展過程中,AQP4表達上調在清除細胞間過量水分的同時,星形膠質細胞卻發(fā)生了水腫,因此,AQP4的表達增高對細胞毒性腦水腫而言是一種不利因素(maladaptationreaction)。抑制AQP4的功能將有利于減輕腦膜炎病程中出現(xiàn)的細胞毒性腦水腫。有研究顯示,在轉染AQP4的人胃腺癌細胞系(humangastricepithelial,HGT-1)中,AQP4可在組胺的作用下發(fā)生內化。本課題組在大鼠的腦缺血模型和眼內高壓模型中,也分別觀察到AQP4內化的現(xiàn)象。而在腦膜炎導致腦水腫的發(fā)生過程中,在AQP4表達增高的同時是否存在腦內AQP4內化的現(xiàn)象,少見文獻報道。本研究觀察到在腦膜炎腦水腫模型中AQP4分別與早期內涵體標記物EEA1和晚期內涵體標記物MPR共表達,提示AQP4內化進入早期內涵體和晚期內涵體。AQP4在細胞膜上的極性分布是其發(fā)揮水轉運功能的重要結構基礎。有離體實驗顯示,AQP4內化可以