魚類細胞肥大虹彩病毒病的流行與防治

魚類細胞肥大虹彩病毒病的流行與防治

虹色病毒主要感染無脊椎動物和低脊椎動物，屬于20個體狀結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)化后的dna病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)共分為5個病毒屬,即虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)和細胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)。其中,細胞腫大病毒屬虹彩病毒是魚類重要病毒性病原之一。近年來在東亞、東南亞和歐洲地區(qū),由該類病毒引起的魚類疾病已呈明顯上升趨勢,患病魚的死亡率從30%(成魚階段)到100%(幼苗階段)不等,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失,嚴(yán)重阻礙了魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展,在國內(nèi)外受到愈來愈大的關(guān)注。為了對魚類細胞腫大虹彩病毒病進行深入的了解,并為該類疾病的研究與防控提供參考,本文將已見報道的由細胞腫大虹彩病毒引起的魚類虹彩病毒病的流行病學(xué)、臨床癥狀、病理學(xué)和病毒的檢測技術(shù)、傳播途徑、致病機制、免疫防治等方面的研究進展綜述如下。1病毒屬石斑魚類型病毒,與nsiv、魚病毒和理化聚合酶系統(tǒng)發(fā)育迄今為止,文獻報道的魚類細胞腫大病毒屬虹彩病毒已有20余種,該屬虹彩病毒感染的硬骨魚類包括鱸形目、鰈形目、鱈形目和鲀形目等4目近百種海水、淡水魚類。1992年,InouyeK等在患病真鯛(Pagrusmajor)的組織切片中觀察到壞死組織中存在可被姬姆薩染色的異常肥大細胞,并在肥大細胞中發(fā)現(xiàn)了真鯛虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)。這是第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞腫大病毒屬虹彩病毒。NakajimaK等從患病鱸魚(Lateolabraxsp)、日本條石鯛(Oplegnathusfasciatus)體內(nèi)各分離出一種虹彩病毒,并將它們分別命名為海鱸虹彩病毒(Seabassiridovirus,SBIV)和日本條石鯛虹彩病毒(Japaneseparrotfishiridovirus,JPIV)。JungSJ等報道韓國南部海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖的條石鯛暴發(fā)了一株虹彩病毒病,患病魚死亡率高達60%。DoJW等測定了該病毒的基因組序列,發(fā)現(xiàn)該病毒ATP酶(adenosinetriphosphatease,ATPase)和DNA聚合酶(DNApolymerase,DPOL)的基因序列與RSIV的同源性分別高達99%和97%,并將其命名為條石鯛虹彩病毒(Rockbreamiridovirus,RBIV)。2005年,DoJW等從韓國沿海5個地域的患病牙鲆(Paralichthysolivaceus)體內(nèi)分離出13株虹彩病毒,通過對病毒的主要衣殼蛋白(majorcapsidprotein,MCP)基因及氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)這些病毒株與RBIV、RSIV、ISKNV等病毒的同源性較高。DanayanolY等報道了由一種虹彩病毒引起的泰國養(yǎng)殖點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)昏睡病,SudthongkongC等依據(jù)病魚病征將該病毒命名為石斑魚昏睡病虹彩病毒(Groupersleepingdiseaseiridovirus,GSDIV)。在我國,多種細胞腫大病毒屬虹彩病毒陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),其宿主幾乎涵蓋了我國主要的海水養(yǎng)殖魚類以及重要的淡水養(yǎng)殖魚類。1992年在臺灣澎湖養(yǎng)殖的石斑魚(Epinephelussp)、真鯛等暴發(fā)了一種虹彩病毒病,該病毒可導(dǎo)致養(yǎng)殖石斑魚、真鯛等大量死亡,死亡率高達60%~100%。ChouHY等通過回歸感染試驗證明了病毒的致病性,并依據(jù)病毒形態(tài)特征將其命名為臺灣石斑魚虹彩病毒(Taiwangrouperiridovirus,TGIV)。1994年廣東省養(yǎng)殖鱖魚(Sinipercachuatsi)暴發(fā)性流行病是由虹彩病毒引起,在病魚脾臟組織中觀察到截面呈六角型、直徑約150nm的球狀病毒。由于該病毒主要感染鱖魚的脾臟和腎臟,HeJG等建議將該病毒命名為傳染性脾腎壞死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)。WengSP等報道了廣東網(wǎng)箱養(yǎng)殖的石首魚(Sciaenopsocellata)患有病毒性傳染病,通過對病魚的臨床癥狀、病理及病毒的核酸序列分析后將其鑒定為虹彩病毒。2003年ChenXH等從福建沿海養(yǎng)殖場患病大黃魚(Larimichthyscrocea)體內(nèi)分離到一種病毒,通過組織病理和病毒形態(tài)學(xué)分析,鑒定為大黃魚虹彩病毒(Largeyellowcroakeriridovirus,LYCIV)。ShiCY等在山東半島患病大菱鲆的病變細胞內(nèi)觀察到一種20面體狀病毒顆粒,并根據(jù)病毒的形狀、大小、在細胞內(nèi)的位置、靶組織類型以及病毒的MCP和ATP酶基因序列同源比對分析等將其鑒定為虹彩病毒,命名為大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbotreddishbodyiridovirus,TRBIV)。此外,在其他養(yǎng)殖魚類如鯔魚、羅非魚、鱈魚以及觀賞魚類神仙魚、非洲燈眼鳉和小密鱸等患病魚體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了不同種類的細胞腫大病毒屬虹彩病毒?？偟膩碚f,細胞腫大虹彩病毒在東亞和東南亞發(fā)現(xiàn)最早、種類最多、流行最為廣泛、感染的魚類品種也最多,而在美洲、歐洲等地區(qū)則較為少見。2組織病理學(xué)檢測感染細胞腫大病毒屬虹彩病毒的病魚,其外觀臨床癥狀一般包括:體表無明顯損傷,嗜睡,游泳異常;貧血癥狀明顯,血液稀薄、色淡,凝固性差,鰓外觀呈暗灰色;腎臟失血,呈灰白色等。但病魚的臨床癥狀也存在一定的差異,如ShiCY等報道,感染TRBIV的大菱鲆病魚腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、發(fā)紅,側(cè)鰭、尾鰭、胸鰭及鰭基部充血、發(fā)紅。而KimWS等則發(fā)現(xiàn),感染TBIV(Turbotiridovirus)的大菱鲆呈現(xiàn)體色蒼白、腹部膨脹、眼睛突出等臨床癥狀。在組織病理學(xué)變化方面,細胞腫大虹彩病毒通常會導(dǎo)致病魚的脾、腎等病毒靶器官內(nèi)出現(xiàn)大量嗜堿性的、細胞質(zhì)勻質(zhì)化的、直徑約15μm~20μm的腫大細胞,這是該類病毒重要的感染特征之一,也是該類病毒被命名為“細胞腫大虹彩病毒”的原因。這些腫大細胞內(nèi)含嗜堿性的包涵體和固縮的細胞核。ShiCY等發(fā)現(xiàn)患病大菱鲆的鰓組織結(jié)構(gòu)松散,次級鰓絲變厚或相互融合,上皮細胞層腫脹、崩解、脫落,柱細胞斷裂、解體;黏液細胞和鹽細胞萎縮,結(jié)構(gòu)不清;次級鰓絲的毛細血管中密實充斥著大量血細胞。病魚脾組織解體,橢圓體鞘崩解,細胞離散,其中分散著大量紅細胞和淋巴細胞;腎臟造血組織肥大細胞內(nèi)線粒體腫脹,內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失。而KimWS等發(fā)現(xiàn)感染TBIV的大菱鲆心內(nèi)膜以及肝臟竇狀隙、實質(zhì)細胞內(nèi)均出現(xiàn)炎癥細胞;魚眼脈絡(luò)膜內(nèi)也出現(xiàn)腫大細胞,并出現(xiàn)壞死灶,腫大細胞的細胞核腫脹、崩解或結(jié)構(gòu)不清。JungSJ等發(fā)現(xiàn)患病石鯛的胃、腸等器官的固有層、黏膜下層、漿膜層出現(xiàn)壞死的上皮細胞。以上這些臨床癥狀和病理變化表明,細胞腫大虹彩病毒病是一種全身性、系統(tǒng)性感染,病毒對魚體上皮組織和內(nèi)皮組織親嗜性較強,對脾臟、腎臟等魚類造血器官和組織的破壞尤為嚴(yán)重,從而導(dǎo)致病魚貧血、多器官衰竭而死亡。3多重pcr技術(shù)的應(yīng)用由于PCR技術(shù)具有特異性強、對感染早期診斷有效,而且檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點,目前已成為檢測虹彩病毒的主要技術(shù)手段。依據(jù)虹彩病毒的MCP、DPOL、DNA轉(zhuǎn)甲基酶、ATP酶、核糖核酸酶還原酶(RNRs)基因以及其他ORFs或限制性酶切核酸片斷序列,已建立相應(yīng)的PCR檢測技術(shù),并成功進行了魚類細胞腫大虹彩病毒的檢測。在此基礎(chǔ)上還建立了其他方法,如JeongJB等利用RSIV的RNRs、ATPase、DPOL基因的保守序列以及PstⅠ酶切核酸片斷,建立了多重PCR技術(shù)應(yīng)用于鑒別RSIV的不同地理株上。ChaoCB等在利用RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA,隨機擴增的多態(tài)性DNA)擴增TGIV的核酸序列基礎(chǔ)上建立了TGIV的套式PCR檢測技術(shù),該技術(shù)的靈敏度達到50fg的病毒核酸。鄧敏等利用ISKNV的RNRs基因保守序列的PCR產(chǎn)物作探針,經(jīng)地高辛標(biāo)記,成功地在病鱖的脾腎組織中進行了病毒的原位雜交檢測,試驗結(jié)果與HE染色、電鏡觀察以及PCR檢測結(jié)果一致。而ChaoCB等利用地高辛標(biāo)記TGIVATP酶基因保守序列的PCR產(chǎn)物合成長為1208bp的核酸探針,建立了TGIV的原位雜交檢測技術(shù),還將該技術(shù)應(yīng)用到TGIV在病魚體內(nèi)感染高峰期的檢測以及病毒精細結(jié)構(gòu)的研究。CaipangCM等依據(jù)RSIV基因組的PstⅠ酶切核酸片斷建立了RSIV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)檢測技術(shù),甚至3pg的病毒核酸亦可以被檢出,比常規(guī)PCR技術(shù)的靈敏度高10倍以上。而WangXW等根據(jù)LYCIVATP酶基因設(shè)計了一種特異性分子信標(biāo)(單鏈熒光核酸探針),并在此基礎(chǔ)上建立了LYCIV的熒光實時定量PCR檢測技術(shù),其靈敏度可達到70個病毒基因組,而且該技術(shù)還能對病魚組織進行病毒的定量檢測。4垂直傳播途徑的研究研究表明,虹彩病毒可通過垂直和水平兩種途徑在仔稚魚、幼魚和成魚間進行傳播。研究者在病魚脾腎等器官中發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子,這說明病毒的感染具有組織特異性,使得病毒能夠在其靶器官中大量復(fù)制;另外,由于脾臟、腎臟是魚類的造血器官,病毒能很快地隨著血液循環(huán),擴散到性腺進行垂直傳播。ChoiSK等在無臨床癥狀條石鯛的白細胞中檢測到RSIV的存在,這表明細胞腫大虹彩病毒有隨血液循環(huán)擴散到性腺進行垂直傳播的可能。而從病魚生殖腺提取的病毒懸液具有感染性的試驗也說明病毒垂直傳播的存在。吳淑勤等采用PCR技術(shù)在表型健康的鱖親魚的精巢和卵巢中均檢測到ISKNV的存在,而在表型健康子代內(nèi)臟中的檢測結(jié)果亦呈現(xiàn)陽性,以上結(jié)果表明病毒能以潛伏的形式存在于病魚體內(nèi)進行垂直傳播,而病毒的流行病學(xué)調(diào)查也證明垂直傳播途徑客觀存在。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),虹彩病毒主要是通過水平途徑在水體、餌料和魚體間進行傳播和感染。曾慷等通過ISKNV的人工感染試驗發(fā)現(xiàn)體表劃痕、腹腔注射、浸泡和口服等途徑均能引起鱖魚患典型病癥,結(jié)果證明病毒存在以食物鏈、體表感染等方式進行水平傳播。而病毒的分子生物學(xué)分析結(jié)果證實,不同地區(qū)間的水產(chǎn)貿(mào)易進一步促進病毒發(fā)生跨地域、跨物種間的傳播。此外,在ISKNV的人工感染試驗中發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖水溫為20℃時感染魚無死亡,隨水溫的上升,感染魚的死亡率增加。而ChoiSK等利用相同的試驗證明,RSIV在水溫低于18℃時以潛伏的形式存于條石鯛體內(nèi),水溫上調(diào)的過程中病魚的累積死亡率增加。由此可以看出,虹彩病毒的傳播與感染存在溫度依賴性。5caspase-3和tnf受體樣在不同形態(tài)變化特征下發(fā)生的作用魚類虹彩病毒主要是通過以下兩種方式對感染細胞造成損傷:①誘導(dǎo)宿主細胞凋亡;②從宿主細胞中出芽釋放或直接裂解宿主細胞。研究表明,虹彩病毒能誘導(dǎo)其敏感細胞系發(fā)生凋亡,從而對感染細胞造成損傷。ImajohM等根據(jù)RSIV誘導(dǎo)的GF細胞在凋亡中后期的形態(tài)變化特征,驗證了caspase-3和caspase-6在凋亡中發(fā)生作用。目前已在多株虹彩病毒的核酸序列中鑒定出TNF受體(TumornecrosisfactorReceptor)樣同源序列,而TNF受體樣同源序列可能在虹彩病毒誘發(fā)的級聯(lián)凋亡中發(fā)生作用。病毒通過出芽釋放破損細胞膜進而損傷宿主細胞是虹彩病毒主要的致病機制之一。病毒的核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體首先進入部分形成的核衣殼中,然后核衣殼封閉形成完整的病毒粒子,進而借助自身的膜趨向性蛋白與宿主細胞質(zhì)膜或其他內(nèi)膜相互作用進入細胞。如ISKNV通過細胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體)芽殖的方式形成包膜,進而在通過出芽方式釋放完整病毒粒子的同時導(dǎo)致細胞裂解,細胞膜破裂,并最終使病毒靶器官受到破壞,失去正常的免疫功能,以致病毒通過循環(huán)系統(tǒng)擴散到全身器官組織,從而導(dǎo)致宿主死亡。6rsiv的免疫疫苗是防控魚類病毒病的重要手段,在細胞腫大虹彩病毒的滅活疫苗、核酸疫苗以及基因工程疫苗等方面已有較多的研究報道。NakajimaK等報道了利用甲醛滅活的RSIV疫苗對5種海水魚類進行免疫接種,對照組死亡率為73%~100%,免疫組的成活率為55%~100%。目前在日本,應(yīng)用于RSIV的滅活疫苗已經(jīng)商業(yè)化。CaipangCM等利用RSIVMCP基因和一個編碼跨膜蛋白的ORF構(gòu)建了RSIV的2個核酸疫苗表達質(zhì)粒pCMV-MCP和pCMV-569,并用它們對真鯛幼魚進行免疫接種試驗。在以接種空載體和PBS對照組的免疫保護率為0的條件下,接種pCMV-MCP、pCMV-569及其二者聯(lián)合免疫試驗組的免疫保護率分別為42.8%、71.4%和71.4%,再次免疫試驗組的免疫保護率分別為68.7%、67.7%和67.7%,免疫組真鯛的MHCI、MHCⅡ和IgL在接種疫苗約1周后分別得到較高的表達,說明RSIV的核酸疫苗具有良好的免疫效果和較高的保護率。何建國等在鑒定出ISKNV的2個膜蛋白、4個環(huán)指蛋白具有泛素連接酶活性的基礎(chǔ)上,確定了2個基因工程疫苗,中和試驗表明這2個基因工程