質(zhì)量放大壓電免疫傳感器檢測(cè)血清k的應(yīng)用

質(zhì)量放大壓電免疫傳感器檢測(cè)血清k的應(yīng)用

0tk基因的誘導(dǎo)表達(dá)胸苷激酶（tk）是與細(xì)胞分離和生殖密切相關(guān)的重要激酶。TK有兩種主要同工酶,TK1存在于細(xì)胞質(zhì),而TK2存在于線粒體。雖然體液中TK的來源和機(jī)制尚不清楚,TK蛋白本身沒有信號(hào)肽,但是推測(cè)體液中的TK很可能是細(xì)胞崩解或腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的,因此,TK可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的一個(gè)指標(biāo)。有觀點(diǎn)認(rèn)為,TK的升高或減低與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究小組用DNA重組技術(shù)克隆了TK基因,在大腸桿菌中表達(dá)了TK,通過免疫Balb/C小鼠制備單克隆抗體,并建立了一種用于TK檢測(cè)的質(zhì)量放大壓電免疫傳感器。本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量放大壓電免疫傳感器方法檢測(cè)了健康人、良性腫瘤以及肝癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤患者血清中的TK,旨在探討質(zhì)量放大壓電免疫傳感器方法檢測(cè)血清中TK以及將其作為惡性腫瘤新型標(biāo)志物的可行性,為進(jìn)一步將TK檢測(cè)用于的惡性腫瘤臨床診斷奠定基礎(chǔ)。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例年齡性別分布實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來自湖北省中山醫(yī)院和湖北省腫瘤醫(yī)院的腫瘤患者血清。其中肝癌69例,男61例,女8例,年齡23～80歲,平均年齡(53.65±12.25)歲;胃腸惡性腫瘤39例,男22例,女17例,年齡28～81歲,平均年齡(61.89±15.33)歲;肺癌25例,男17例,女8例,年齡36～75歲,平均年齡(57.33±11.25)歲;生殖系統(tǒng)惡性腫瘤26例,男6例,女20例,年齡36～75歲,年齡25～82歲,平均年齡(55.52±13.61)歲;乳腺癌13例,均為女性,年齡37～64歲,平均年齡(49.70±8.05)歲;其他惡性腫瘤21例(膽管癌5例,胰頭癌6例,腎癌1例,腦轉(zhuǎn)移癌1例,鼻咽癌3例,胰腺癌1例,惡性胸水1例,胃癌肺轉(zhuǎn)移1例,頜下腺癌1例,腺癌淋巴轉(zhuǎn)移1例),男11例,女10例,年齡41～83歲,平均年齡(57.25±17.57)歲;良性腫瘤患者血清15例,男4例,女11例,年齡27～70歲,平均年齡(47.60±10.13)歲;健康人血清30例,男13例,女17例,所有血清樣品均為醫(yī)院常規(guī)采集的清晨靜脈血分離得到,收集后貯于-20℃冰箱中。1.2實(shí)驗(yàn)室用ppl電路CN3165型高分辨計(jì)數(shù)器(石家莊無線電器廠);石英晶振:AT切割(JA5型),9MHz,兩面被金電極,芯片直徑12mm,電極直徑6mm,振蕩電路為實(shí)驗(yàn)室自制TTL電路。TK、抗TK單克隆抗體(Anti-TKAb)和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗TK單克隆抗體(HRP-Anti-TKAb)均為本研究組制備,方法已另文報(bào)道。1.3壓電免疫傳感器的制備按本研究組報(bào)道的質(zhì)量放大壓電免疫傳感器方法,將本研究組制備的Anti-TKAb通過巰基自組裝膜共價(jià)固定于壓電石英晶振表面,制備得到hTK壓電免疫傳感器,將血清樣品以1∶1稀釋進(jìn)行測(cè)定。1.4血清細(xì)胞因子檢測(cè)進(jìn)行t檢驗(yàn)處理,分別計(jì)算不同惡性腫瘤血清與正常人血清、惡性腫瘤血清與良性腫瘤血清以及良性腫瘤血清與正常人血清的頻移值之間的統(tǒng)計(jì)量t,分析其間差異性。2結(jié)果2.1傳感器頻率響應(yīng)tk濃度的影響測(cè)量了一系列不同濃度的TK溶液(用TK純品配制),得到了TK濃度與傳感器頻率響應(yīng)的關(guān)系曲線,見圖1。通過線性回歸分析,得到頻移值與TK濃度的線性相關(guān)方程,Y=77.4-14.7X,γ=0.9955。2.2乳腺癌血清tk、tk水平比較采用質(zhì)量放大壓電免疫傳感器方法對(duì)不同惡性腫瘤血清、良性腫瘤血清以及正常人血清進(jìn)行了檢測(cè),見表1。結(jié)果顯示,肝癌血清的TK水平最高,69例肝癌血清的平均頻移值為(59.4±3.38)Hz,TK水平為(2.44±0.46)ng/ml;其次為乳腺癌血清,其頻移值為(68.9±1.75)Hz,TK水平為(1.16±0.24)ng/ml。兩者的TK水平存在顯著性差異。同時(shí),兩者的TK水平均明顯高于其他惡性腫瘤血清(P<0.001)。肺癌、胃腸惡性腫瘤、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤以及其他惡性腫瘤血清間的TK水平接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而良性腫瘤患者血清與正常人血清的TK水平更低,低于傳感器的線性檢測(cè)范圍,實(shí)驗(yàn)中所有惡性腫瘤血清樣品的頻移值與其比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外,良性腫瘤血清的頻移值亦顯著大于正常人血清,TK水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。3tk的檢測(cè)結(jié)果TK能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的轉(zhuǎn)化,與細(xì)胞的分裂和增殖有密切關(guān)系,是一種較為敏感的新的腫瘤標(biāo)志物。目前國(guó)際上仍主要采用放射免疫法測(cè)定血清TK的活性和含量,但是長(zhǎng)期采用放射性方法,存在一定的放射性污染,且需要比較昂貴的儀器設(shè)備和放射性試劑,難以在臨床診斷和普查中推廣應(yīng)用。本研究組自主制備得到了TK和相應(yīng)的抗TK單克隆抗體,并將抗TK單克隆抗體固定于壓電石英晶振表面,研制的質(zhì)量放大TK壓電免疫傳感器。這種傳感器方法靈敏度高、操作方便,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、數(shù)字化,無需昂貴的儀器設(shè)備,所用的試劑用量少、價(jià)格低廉,而且線性回歸分析結(jié)果顯示,傳感器的頻移響應(yīng)與TK濃度具有很好的相關(guān)性(γ=0.9955),可準(zhǔn)確得到TK濃度的信息。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了一系列不同類型腫瘤血清樣品的TK水平,結(jié)果顯示表明無論是惡性腫瘤還是良性腫瘤患者血清的頻率響應(yīng)均比健康人血清大,表明腫瘤患者由于細(xì)胞的過度增生,TK作為DNA合成的關(guān)鍵酶與細(xì)胞分裂密切相關(guān),表達(dá)的TK蛋白迅速增加,血清中TK水平亦明顯升高,與健康人血清差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),我們尚發(fā)現(xiàn)不同類型的惡性腫瘤血清樣品,其TK水平亦有明顯的區(qū)別,其中肝癌血清最高(2.44±0.46)ng/ml,其次為乳腺癌血清(1.16±0.24)ng/ml,兩者的TK水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均明顯高于其他惡性腫瘤血清(P<0.001)。而肺癌、胃腸惡性腫瘤、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤以及其他惡性腫瘤血清間的TK水平接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？梢奣K完全可以作