石蠟制片技術

石蠟制片技術三、實驗原理·

石蠟切片的原理是利用石蠟的熔點是

58C左右和對不同化學物質溶解性不同，通過透明劑，在石蠟熔點以上，將石

蠟滲透進入植物組織和細胞之間，當

溫度降低到石蠟熔點以下時，凝結成

固態(tài)固定組織和細胞以利于切片。一、石蠟制片技術的優(yōu)點石蠟切片法是一種最常用的顯微制片方法，它的優(yōu)點是可切出大量極薄的連續(xù)切片，且成本教低。石蠟切片技術適應細胞水平的研究。二、實驗目的·了解石蠟切片的基本原理，掌握石蠟切片的基本過程和制作方法，學會制作石蠟切片中一些常用試劑的配制方法，認識石蠟切片的實用范圍。四、實驗器材、試劑·

手搖切片機、展片臺、溫箱、鑷子、解剖刀、酒精燈、蓋玻片、指形管等。番紅染色液、固綠染色液、FAA固定液、二甲苯、各級酒精、石蠟、加拿大樹

膠、蛋白膠等五、石蠟制片的操作流程（一）

取材（二）固定和抽氣（三）脫水、透明及滲蠟（四）

包埋（五）修塊、切片和燙片（六）烘干（七）脫蠟、染色、脫水、透明（八）封片（一）取材·

選取經(jīng)過自己設計實驗的對照和處理的材料，根據(jù)不同的要求，從植物體上選取有代表性的器官或組織，取材力求新鮮，以避免組織發(fā)生死后變化。取材時要用快刀切割材料，不能擠壓，所取的材料不宜過大，在不影響觀察的情況下應盡可能小些，這樣有利于藥劑透入組織和細胞中。（二）固定和抽氣·

（一）將切取的植物材料放入固定液中，使其細胞原生質在極短的時間內停止生命活動，盡量保持細胞原有的細微結構，也可使某些柔軟的材料適當硬化，便于切片。材料的長和寬最大不超過1cm。固定液為材料的

20倍左右。固定時間24小時，其間要放入抽真空機中抽氣15-30分鐘至材料完全沉浸在固定液下面。并用鉛筆寫好標簽。固定劑的種類1.福爾馬林—醋酸—酒精固定劑（FAA）·

70%或50%酒精

90CC冰醋酸

5CC福爾馬林

5CC2.醋酸—酒精固定劑（卡諾固定劑）此固定劑的主要成分是冰醋酸和純酒精，也可加入氯仿。純酒精（95%酒精）

3份冰醋酸

1份（三）脫水、透明及蠟將材料從固定液中取出后，其具體流程如下：A：酒精X：二甲苯·

70%A（2h）→85%A（2h）→95%A（2h）→100%A（2h）→100%A（2h）→3/4A+1/4X（2h）→1/2A+1/2X（2-3h、過夜）→1/4A+3/4X（2h）→X（2h）→1/2X+1/2蠟（過夜）→

蠟1（2h）→

蠟2（2h）→

蠟3（2h）（四）

包埋· 將滲蠟后的材料和石蠟一起倒入小紙盒，用加熱的鑷子迅速把材料按需要的切面和一定的間隔排列整齊并使其豎直，倒入純蠟進行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中徹底冷卻凝固。（五）修塊、切片和燙·

1、修塊片將包埋好的材料切割成小塊，每個小塊包含一個材料，并修成梯形，切面在梯形的上部。注意上部矩形對邊平行，梯形底部用燒熱的蠟將其固定在木塊上。

2、切片將粘有蠟塊的小木塊至于切片機上，調整切距到適當大小，轉動調節(jié)器條切片厚度12μm左右進行切片。注意切片時要一手轉動切片機，另一手執(zhí)毛筆將切下來的片子攤開以形成一長條蠟帶。

3、

燙片

滴一滴蛋白膠于干凈載玻片中央，用干凈的手指涂抹均勻后，滴上清水，將取下的蠟帶切成小段置于載玻片上（放上兩至三段），然后將載玻片放到展片臺上(保持40℃)燙片。

待充分燙平后用吸水紙吸去多余的水。（六）烘干·

將燙好的片子自然烘干，或

45℃烤片箱干燥1~2天，注

意防塵。（七）脫蠟、染色、脫水、透明·

將玻片標本放于100%X（15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番紅（85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s）→固綠（100%A配制）(30s)→95%A(1-2min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min）→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min)·

注意番紅染色時間要長些（至少3h以上），隨后的兩次經(jīng)過酒精的時間都應很短，以免洗掉染上的番紅，固綠的染色時間大約在20-30s,其他各步的時間大約1至2分鐘，均要視具體情況而定。番紅—固綠染色法此法應用甚廣，是研究植物一般形態(tài)結構的重要方法。番紅為堿性染料，常用的是混合物（二甲基酚番紅，三甲基酚番紅），可將細胞核、染色體、核仁等染成紅色，對木化、栓化、角化的細胞壁也有很好的染色效果。固綠為酸性染料，能對細胞質、纖維素細胞壁染色。番紅與固綠對染，效果很好。番紅染液配法配方藥品IIIIIIIV番紅1g1g1g1g蒸餾水100cc5%酒精95cc70%酒精100cc95cc苯胺油5cc5cc固綠染液配法配方藥品IIIIIIIVVVI固綠0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.3-0.5g1-2g95%酒精100cc無水酒精100cc50-60cc95cc80cc苯胺油5cc20cc丁香油100cc40-50cc鐵礬—蘇木精染色法次法在細胞學及胚胎學上廣為應用，是顯示細胞一般結構及細胞分裂的良好染色方法，它能將細胞核、細胞分裂時的染色體染成藍黑色，且能長久保持顏色。蘇木精（C16H14O6）不能直接染色，必須氧化成熟為氧化蘇木精，同時還要經(jīng)過媒劑的作用，才能染上顏色，所以這種染色法必須配制兩種溶液。染液的配制甲液：4%鐵礬（硫酸鐵胺）水溶液，這是一種媒染劑，沖淡成2%的濃度時，又可作分色劑使用，臨用時配用較好。乙液：蘇木精10g+無水酒精100CC，這是母液，要經(jīng)1—2個月才能氧化成熟，染色時，將此母液5CC加入100CC蒸餾水，沖

淡應用。染色過程·

玻片材料經(jīng)脫蠟、各級酒精、蒸餾水，進入

4%鐵礬媒染05—4小時，水洗約5分鐘，換

蒸餾水2次，每次2—3分鐘，然后05%蘇木

精染色1—4小時或更長，蒸餾水換洗數(shù)次，再用2%鐵礬分色，一般大約半分鐘至數(shù)分

鐘。在分色時，要隨時在低倍鏡下檢查，直到滿意為止。然后，用水沖洗30分鐘，最

后換蒸餾水數(shù)分鐘。（八）封片、干燥、貼標簽1、從二甲苯中取出然好色的片子，用中性樹膠進行封片。注意封片用的該玻片要清潔，封片時要注意不要產生氣泡。2、一般一