第三章 固定化酶反

第三章固定化酶反第1頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1酶的固定化背景酶的固定化方法影響固定化酶活力的因素固定化對酶動力學特征的影響第2頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.1背景游離酶參與反應的缺點：1）穩(wěn)定性差、液相中含量少，2）反應結(jié)束后不易回收、3）酶、底物和產(chǎn)物處于同一相，對產(chǎn)物分離不利固定化酶：即水不溶性酶，是通過物理的或化學的方法，將溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi)其運動受到完全約束，或受到局部約束的一種不溶于水但仍具有催化活性的酶，它能以固相狀態(tài)作用于底物進行催化反應其優(yōu)點：可以長期保留在反應器內(nèi)反復使用，易實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)；反應結(jié)束后易與產(chǎn)物分離，簡化了產(chǎn)物分離工藝，其大多數(shù)固定化酶穩(wěn)定性也比游離酶好缺點：活力會下降，反應易受傳質(zhì)速率的控制，對大分子底物、產(chǎn)物不適用研究歷史：1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)酵母蔗糖酶能被吸附到骨碳粉末上，并在吸附狀態(tài)下具有催化活性；以后以色列科學家對酶的固定化方法、固定化的理化性質(zhì)等進行了開創(chuàng)性的研究，1969年日本的千葉一郎將固定化氨基酸?；笐糜贒L－氨基酸的拆分上，1971年國際酶工程會議給出了固定化酶的定義。第3頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.2酶的固定化方法載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理結(jié)合法離子結(jié)合法共價結(jié)合法凝膠包埋微膠囊包埋纖維素包埋第4頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月影響固定化酶催化活力的因素構(gòu)象效應：由于載體與酶之產(chǎn)的共價鍵作用，引起酶的活性部位發(fā)生扭曲變形，改變了酶活性部位的三維空間結(jié)構(gòu)，減弱了酶與底物的結(jié)合力，導致酶的活性下降。位阻效應：由于載體選擇不當或載體空隙太小，致使酶的活性部位不易與底物結(jié)合，對酶的活性部位造成了空間障礙。分配效應：由于固定化酶載體的親水性、疏水性及靜電作用等，使得底物和產(chǎn)物及其效應物在微環(huán)境和宏觀環(huán)境中濃度不同的現(xiàn)象。擴散效應：底物、產(chǎn)物和效應物的遷移和運轉(zhuǎn)速率受到限制的一種效應。第5頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的固定化對其動力學特征的影響原因：由于酶的活性中心的氨基酸殘基的空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)發(fā)生了變化，或者固定化酶的周圍形成了能對底物傳遞產(chǎn)生影響的擴散層或靜電的相互作用等。對底物專一性的改變穩(wěn)定性的改變最適pH值和溫度的改變米氏常數(shù)的改變第6頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2外擴散的限制作用特點液固相間的傳質(zhì)速率外擴散的限制作用外擴散有效因子第7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2.1外擴散的特點酶促反應過程與傳質(zhì)過程是各自獨立的底物先從液相主體擴散到固定化酶的外表面發(fā)生反應產(chǎn)物從固定化酶的外表面擴散進入液相主體第8頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2.2液固相間的傳質(zhì)速率由于攪拌，反應體系中的液相主體的底物濃度處處相同，假定為S0，底物在顆粒表面因反應而消耗，同時由于液體的粘性，在固液表面附近產(chǎn)生一個滯流層，而固體表面液體流速率為0，因而在滯流層產(chǎn)生濃度梯度，進而導致物質(zhì)的傳遞，且傳質(zhì)阻力全部集中在滯流層。根據(jù)Fick第一定律，得液固相間的傳質(zhì)速率為其中Ds為底物在液相中的分子擴散系數(shù)，m2/sa為固定化酶的比表面積，m-1

S0SiRR+δ第9頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2.3外擴散的限制作用固定化酶外表面的反應速率可表示為當化學反應速率和傳質(zhì)速率相差不大時，體系在穩(wěn)態(tài)條件下，有下式成立，傳質(zhì)速率＝化學反應速率，即：求解此方程，得出無因次化處理，令第10頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月解之得：，當B>0時取+號；當B<0時，取-號，其中。這里，Da準數(shù)是對反應控制步驟時行描述的一個重要的無因次數(shù)群，其物理意義為，因此當Da>>1（50）時，此時固定化酶反應的控制步驟為傳質(zhì)，此時Si=0,RSi=KLaS0，反之，當Da<<1(0.1)，此時固定化酶反應的控制步驟為動力學（化學反應速率），即Si=S0，，稱為最大本征反應速率。第11頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2.4外擴散有效因子，根據(jù)此定義式知：因此可以根據(jù)判斷外擴散的影響。因此在利用固定化酶進行反應時，總是希望盡可能接近1，此時應控制反應條件，使Da準數(shù)盡可能地小，由知，可以通過降低固定化酶顆粒的粒徑，提高液體的流速及適當增加液相主體的底物濃度來使Da減小。第12頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月的關系由圖中可以看出：當?shù)孜餄舛仍黾佣鳧a不變時，隨著底物濃度的增加，增加，即增加底物濃度，可以克服外擴散的影響，當?shù)孜餄舛炔蛔儠r，Da增加，減少，且當Da<0.1時，接近1。第13頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月可觀測丹克萊爾準數(shù)（）令，當傳質(zhì)速率和反應速率相差不大時，在穩(wěn)定狀態(tài)下有下式成立，，因此得到，從此式中可以看出：當時，，外擴散影響可忽略，當時，，外擴散影響明顯。怎樣識別外擴散的影響？第14頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3內(nèi)擴散的限制作用特點液體在微孔內(nèi)的擴散速率微孔內(nèi)反應與擴散的關系式內(nèi)擴散有效因子表觀泰勒模數(shù)第15頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.1內(nèi)擴散的特點對于多孔的固定化酶顆?；蚰ぃ哂写呋饔玫牟课换旧鲜窃谖⒖椎膬?nèi)表面，因此擴散過程和反應過程是同時發(fā)生的。在微孔內(nèi)，由于內(nèi)擴散阻力的存在，反應組分在微孔內(nèi)的濃度分布是不均勻的，對于底物，其濃度在固定化酶外表面處最高，在顆?；蚰ぶ行奶幾畹?，形成了由表及里濃度逐漸降低的分布，由于反應和擴散同時進行，所以沿微孔方向，反應速率也在下降，在顆粒中心處，反應速率最低。擴散過程與微孔結(jié)構(gòu)密切相關。第16頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.2液體在微孔內(nèi)的擴散液體在單一圓柱形微孔內(nèi)的分子擴散速率可用Fick第一定律來表示：

其中Ds為底物在液相中的分子擴散系數(shù)，一般在1×10－9m2/sz為沿擴散方向的距離，mNs為底物在單位時間內(nèi)通過單位截面積微孔的量，moL/(m2s)但固定化酶顆?；蚰さ奈⒖资欠菆A柱形的，底物在微孔內(nèi)的擴散系數(shù)要比在液相主體中小得多，工程上采用有效分子擴散系數(shù)來表示。擴散中發(fā)生在微孔內(nèi)，且微孔面積與顆粒外表面積之比等于孔隙率微孔的形狀是彎曲的，因此引入曲節(jié)因子，故在有效分子擴散系數(shù)可表示為第17頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.3微孔內(nèi)擴散與反應的關系式球狀固定化酶片狀固定化基本假設模型的建立顆粒內(nèi)底物濃度與擴散阻力的關系第18頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.3.1球狀固定化酶之基本假設固定化酶顆粒是等溫的顆粒內(nèi)傳質(zhì)為擴散，且服從Fick第一定律，Des不隨位置而變化顆粒是均勻的，不僅其活性分布均勻，性質(zhì)也均勻底物與產(chǎn)物分配系數(shù)為1，固定化酶活性穩(wěn)定反應為單底物限制，底物與產(chǎn)物的濃度僅沿半徑方向變化第19頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月球狀固定化酶之模型的建立假定球狀固定化酶的半徑為R，在距球中心為r處取一殼層，其厚度為dr，底物通過微孔由外向內(nèi)擴散，且通過此殼層，底物在（r+dr）處擴散進入，在r處離開，并在殼層內(nèi)發(fā)生酶促反應而消耗底物，以擴散方面為正方向，則單位時間內(nèi)擴散進入微元殼層的底物的量為單位時間內(nèi)由擴散離開微元殼層的底物的量為：單位時間內(nèi)微元殼層內(nèi)的底物的反應量為在穩(wěn)態(tài)條件下，沿擴散方向，底物的物料衡算式可表示為流入量－流出量＝反應量，即：rr+dr擴散方向第20頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月上式可變?yōu)椋嘏藕蟮脙蛇呁詒2dr，得即上式變?yōu)?/p>

第21頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關系之一雙曲函數(shù)，首先要進行無因次化處理：令

對于球形固定化酶，，則有

第22頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月整理：即：，利用邊界條件求解：該方程無解析解，只有數(shù)值解（數(shù)值計算法是研究數(shù)學問題的一類近似解法，即從一組原始數(shù)據(jù)，按照某種確定的運算規(guī)則，進行有限步運算，最終獲得數(shù)學問題數(shù)值形式的滿足某種精度要求的近似解，如龍格庫塔法，近似解也可做成圖）第23頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月底物濃度沿半徑分布圖從右圖可以看出，對同一位置r處，隨著Φ的增加，底物濃度在減少。Ф的大小，表征了內(nèi)擴散阻力的大小，因此隨內(nèi)擴散阻力的增大，同一位置處底物濃度減小，而且當Ф不變時，愈往顆粒內(nèi)部，底物濃度越小。當內(nèi)擴散阻力較小時，Ф＝0.2,1,底物可以到過顆粒中心處，但當內(nèi)擴散阻力較大時，Ф=5,10,底物還未達到顆粒中心處就反應掉了。圖第24頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關系之二當，同樣對進行無因次化處理，得，同樣給定邊界條件進行求解，得第25頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月球狀固定化酶之顆粒內(nèi)底物濃度與阻力的關系之三當對于零級反應動力學，反應速率與底物濃度無關，但要發(fā)生反應，必須有底物存在，同樣給定邊界條件對其進行求解，得當?shù)孜餄舛纫欢〞r，使固定化酶顆粒中心處底物濃度恰好為0的顆粒半徑，稱為臨界半徑，第26頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.3.2片狀固定化酶假定酶膜的厚度為2L，但厚度與其長度與寬度相比要小得多，因此底物的擴散只考慮與兩個大的側(cè)面相垂直方向上的擴散，而忽略其他四個側(cè)面的擴散，同樣取一厚度為dl的微元體，做底物的物料衡算：假定酶膜的面積為A，則單位時間進入微元體底物量表示為單位時間流出微元體的底物量為

單位時間內(nèi)微元體內(nèi)反應的底物量為擴散方向第27頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月對底物進行物料衡算：流入－流出＝反應消耗同樣，底物沿擴散方向的濃度分布與rs的形式有關，當酶膜完全浸在反應液中時，若，同樣進行無因次化處理，令

則上式變?yōu)?，同樣給定邊界條件：同樣此方程只有數(shù)值解，沒有解析解。第28頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月當，無因次化處理得，解得

當

同樣也存在臨界厚度的問題：第29頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.4內(nèi)擴散有效因子內(nèi)擴散有效因子的定義一級反應動力學表達式有效因子的一般表達式零級反應表達式第30頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.4.1有效因子的定義定義：在穩(wěn)態(tài)條件下，RS應等于從顆粒外表面處向微孔擴散的速率，即當無外擴散影響時，，對于球狀固定化酶，第31頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.4.2一級反應當，

即而對于片狀固定化酶第32頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月固定化酶形狀對有效因子的影響隨著的增加，下降，當，為動力學控制區(qū)，說明內(nèi)擴散阻力很小，但當>3時，內(nèi)擴散阻力明顯，內(nèi)擴散成為控制步聚，此時，為過渡區(qū)。此外，固定化酶幾何形狀不同，對關系影響不大，特別是在較小或較大時。第33頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.4.3有效因子的一般形式當對于球狀固定化酶，進行無因次化處理，則因為S~r之間無解析解，因此亦無解析解，因而

第34頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月由此可看出，當增加時，下降，而，從中可以看出影響泰勒模數(shù)的因素：1）顆粒大小或厚度，即，對的影響明顯，又稱為特征尺寸，越大，值越大，越小，因此為了減少內(nèi)擴散的影響的限制，反應中應盡可能采用小顆粒。2）顆?；钚?，即動力學參數(shù)3）有效分子擴散系數(shù)第35頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.4.4零級反應動力學對于零級反應動力學，只要整個球形固定化酶顆粒內(nèi)部有底物存在，反應就可以進行，此時，若由于內(nèi)擴散的影響，使得底物在固定化酶顆粒某一位置r處濃度為0，則定義一個零級反應的泰勒模數(shù)，來計算零級反應的有效因子，定義：對于球形固定化酶，

第36頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.3.5表觀泰勒模數(shù)定義：，對于球形固定化酶，由得當?shù)?7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4擴散影響下的假象擴散影響的判定擴散對反應級數(shù)的影響擴散對活化能的影響擴散對固定化酶穩(wěn)定性的影響第38頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3.4.1擴散影響的判定直接法：如果在相同的反應條件下，只改變底物的流速，如果流速改變，底物的轉(zhuǎn)化率也隨之改變，說明存在外擴散的影響，繼續(xù)提高流速，轉(zhuǎn)化率不再改變，說明消除了外擴散的影響，在此基礎上，維持相同的反應條件，只減少固定化酶的特征尺寸，隨著特征尺寸的減少，，底物的轉(zhuǎn)化率增加，說明存在內(nèi)擴散的影響，繼續(xù)減少特征尺寸，直到底物的轉(zhuǎn)化率不變