不同菌種發(fā)酵過程中生物胺的變化

不同菌種發(fā)酵過程中生物胺的變化

氨基乙酰胺是碳水化合物中的一種含氮化合物。作為人體的正常生理活性物質(zhì)，它對細(xì)胞具有重要的生理功能。當(dāng)人體內(nèi)生物胺含量過多時,會刺激體內(nèi)釋放腎上腺素和去甲腎上腺素,增加胃酸分泌,引起心跳過速、偏頭痛、血糖升高和血壓升高。生物胺的形成主要有2種形式:一種是通過氨基酸的脫羧作用,另一種是通過醛酮類化合物的氨基化或轉(zhuǎn)氨作用形成。生物胺產(chǎn)生的條件有3個:①有可形成生物胺的游離氨基酸,②存在可代謝產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物,③適合該微生物生長的環(huán)境。食品中主要存在的生物胺包括組胺、腐胺、尸胺、酪胺、色胺、β-苯乙胺、精胺和亞精胺。目前關(guān)于食品中生物胺的研究主要是針對魚及魚制品、肉及肉制品、香腸、奶酪、啤酒、紅酒、發(fā)酵蔬菜等食品,在未發(fā)酵的食品中,如魚、肉等,生物胺的產(chǎn)生多是由微生物污染引起的,因此把生物胺作為食品腐敗變質(zhì)的指標(biāo)之一;而在發(fā)酵食品,尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸含量高的食品中,由于微生物的作用,生物胺含量相對較高。Mohamed等研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵魚制品Feseekh在成熟過程中,生物胺總量從83.63mg/kg干基增長到608.72mg/kg干基,經(jīng)過60天儲藏后達(dá)到1633.02mg/kg干基。Favaro等檢測到鮮肉中只含有少量的酪胺、亞精胺和精胺,其他種類生物胺未檢出;而在發(fā)酵香腸和干腌制品中,主要含有酪胺(104~295mg/kg)、腐胺(97~331mg/kg)和尸胺(6~81mg/kg)。腐乳是我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品之一,是以大豆為主要原料,經(jīng)過磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過程制作而成的富含大豆蛋白的發(fā)酵制品。腐乳口感細(xì)膩,營養(yǎng)豐富,有“東方奶酪”之稱,深受消費者的喜愛。隨著對食品安全重視程度的增加,腐乳作為蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高的發(fā)酵食品,存在生成生物胺的可能性,而目前關(guān)于傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中生物胺的研究還很少,因此有必要對腐乳發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生情況進(jìn)行分析。本課題主要研究了腐乳前酵過程中生物胺含量的變化。1材料和方法1.1原材料大豆,中黃13號,由北京中農(nóng)作科技發(fā)展有限公司提供。1.2elegns公司的微生物雅致放射毛霉Actinomucorelegans(王致和腐乳廠),少孢根霉Rhizopusoligosporus(中科院微生物研究所)。1.3主試劑HCl,氨水,丙酮,NaOH,NaHCO3,MgCl2,均為分析純。1.4結(jié)構(gòu)苯磺酸酯nf-苯甲酰胺h色胺(98%)Sigma-AlorichINC,β-苯乙胺(97.5%)DrEhrenstorferGmbH,腐胺(99%)DrEhrenstorferGmbH,尸胺(99%)DrEhrenstorferGmbH,鹽酸組胺(99%)TCI東京化成工業(yè)株式會社,酪胺(>98%)(TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,>98%),亞精胺(99%)、精胺(97%),丹磺酰氯(97%)AlfaAesar。1.5均質(zhì)機、電泳儀高效液相色譜儀(SHIMADZU,10A),真空冷凍干燥機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠,LCJ-10),冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠,GL-20G-II),均質(zhì)機(IKALABORTECHNIK,T25basic),電泳儀(AZZO,AE-8450)1.6方法1.6.1細(xì)菌的激活將菌種劃線于PDA培養(yǎng)基斜面上,28℃活化72h。1.6.2毛霉、少孢根霉的培養(yǎng)將麩皮與水按1∶1.4(g∶mL)混合,置于250mL三角瓶中,于121℃滅菌20min,冷卻后分別接種雅致放射毛霉、少孢根霉,于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3d。加入適量生理鹽水,充分搖動,分別得到雅致放射毛霉孢子懸浮液和少孢根霉孢子懸浮液。鏡檢計數(shù),調(diào)整濃度為107個孢子/mL。孢子懸浮液隨用隨配,不做儲藏。1.6.3無砂漿機構(gòu)造豆?jié){挑選顆粒飽滿的大豆300g,以1200mL去離子水室溫浸泡12h。待大豆泡好后,以1800mL水為溶劑,用磨漿機磨成豆?jié){。過100目篩,加熱,95℃保溫5min,冷卻至80℃,保溫5min,手動攪拌加入100mL1mol/LMgCl2溶液點漿,80℃蹲腦40min,壓榨成型,最后將豆腐切成塊。1.6.4豆腐坯懸浮液添加量將豆腐坯整齊的擺入蒸籠中,將制備好的孢子懸浮液均勻噴灑在腐乳白坯表面,平均每塊豆腐坯噴灑1mL孢子懸浮液。豆腐坯之間間隔為1cm。雅致放射毛霉在28℃,相對濕度88%的條件下進(jìn)行發(fā)酵,少孢根霉在32℃,相對濕度88%的條件下進(jìn)行發(fā)酵,并于24、36、48、60、72h時取樣。1.6.5衍生品溶液的制備取凍干的腐乳樣品2.5g于離心管中,加15mL0.1mol/LHCl,均質(zhì)2min,4℃15800×g離心20min,取上清液,過濾,取1mL濾液定容到5mL,得到樣品稀釋液,取1mL進(jìn)行衍生,作2個平行。1.6.6-氨基-4-3-甲基苯基氨基甲酸乙酯的合成取1mL上述腐乳樣品稀釋液,依次加入200μL2mol/LNaOH、300μL飽和NaHCO3、2mL丹磺酰氯(DCl)(10mg/mL丙酮),40℃暗處理45min,加入100μL25%氨水,靜置30min,乙腈定容到5mL,0.45μm有機系濾膜過濾,備用(4℃避光保存)。1.6.7hplc分析1.6.7.標(biāo)品溶液的配制分別稱取50mg(精確到0.0001g)生物胺標(biāo)準(zhǔn)品,用0.1mmol/LHCl定容到50mL,制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,各取儲備液10mL混合后定容到100mL,制成標(biāo)準(zhǔn)品混合液,再用0.1mmol/LHCl將混合液分別稀釋到100、50、25、10、5μg/mL。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液進(jìn)行衍生,方法同樣品衍生1.6.6。1.6.7.梯度洗脫程序色譜柱:C18柱(4.6mm×250mm,5μm),紫外檢測器,檢測波長254nm,進(jìn)樣量20μL,柱溫40℃,流動相A為水,流動相B為乙腈,流速為0.8mL/min,梯度洗脫程序如下:1.7樣品的制備參照ChurchF.C.的方法有所改動。OPA試劑的配制:取50mL0.1mol/L四硼酸鈉溶液,5mL0.2g/mLSDS溶液,0.5mLβ-巰基乙醇,2.5mLOPA溶液(50mg/mL甲醇)混勻,用蒸餾水定容到100mL。取凍干的腐乳樣品1.0g于離心管中,加10mL蒸餾水,均質(zhì)(19000r/min)2min,沸水浴15min,室溫下150r/min振蕩1h,15800g離心20min,取上清液,過0.45μm濾膜,得到樣品水提物,4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00μL樣品水提物加2mLOPA試劑,混勻,靜置10min,340nm測吸光度。以谷胱甘肽做標(biāo)準(zhǔn)曲線,谷胱甘肽濃度分別為0,0.25,0.50,0.75,1.00,1.50,2.00mg/mL。1.8樣品溶液的標(biāo)定參見SB/T10170,稍有改動。取3.000g腐乳凍干樣品于燒杯中,加入20mL水,加熱煮沸,冷卻至室溫后,移入100mL容量瓶中,用水定容至刻度線,混勻,用干燥濾紙過濾,得到樣品濾液。取10mL濾液于150mL燒杯中,加入50mL水,開動磁力攪拌器,用0.1mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2,加入10mL甲醛,繼續(xù)滴定至pH9.2,記下加入甲醛后氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積。同時做空白試驗。2分析與討論的結(jié)果2.1混合胺的hplc檢測結(jié)果通過單個生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC檢測,得到8種生物胺的保留時間,色胺為(10.219±0.031)min,β-苯乙胺為(12.133±0.030)min,腐胺為(12.800±0.030)min,尸胺為(13.760±0.038)min,組胺為(14.680±0.027)min,酪胺為(18.586±0.027)min,亞精胺為(19.411±0.026)min,精胺為(24.164±0.061)min?；旌习返腍PLC檢測結(jié)果可以得出該方法對8種生物胺的分離效果較好(見圖1)。8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見表1,R2均大于0.998,說明峰面積與生物胺含量之間具有很強的線性相關(guān)性。2.2吸光度與濃度的線性關(guān)系谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.4132x-0.0012,且R2=0.9999,說明在0~2.00mg/mL范圍內(nèi),吸光度與濃度有良好的線性關(guān)系。在前酵過程中,多肽含量呈現(xiàn)上升趨勢,在36h內(nèi),雅致放射毛霉發(fā)酵的豆腐多肽含量高于少孢根霉發(fā)酵的,48h后,少孢根霉發(fā)酵豆腐中多肽含量明顯高于雅致放射毛霉發(fā)酵的(圖2),發(fā)酵到72h,雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵的腐乳中多肽含量分別達(dá)到了4.2g/100g、7.2g/100g。2.3植物乳桿菌對乳蛋白總胺和生物胺含量的影響豆腐坯中氨基態(tài)氮的含量很低,經(jīng)過發(fā)酵,雅致放射毛霉和少孢根霉發(fā)酵的腐乳中氨基態(tài)氮的含量均有不同程度的增加,雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳中氨基態(tài)氮含量一直高于少孢根霉發(fā)酵的腐乳,發(fā)酵到72h,氨基態(tài)氮含量分別達(dá)到0.50g/100g、0.40g/100g(見圖3)。在整個發(fā)酵過程中,總胺含量一直呈現(xiàn)上升趨勢,且雅致放射毛霉發(fā)酵產(chǎn)生總胺含量一直高于少孢根霉發(fā)酵產(chǎn)生的總胺含量(見圖4),發(fā)酵到72h時,總胺含量分別達(dá)到971.1mg/kg和782.0mg/kg。Nout等研究了少孢根霉發(fā)酵的天培(tempe)中總胺含量的變化,少孢根霉發(fā)酵的天培中總胺含量大約為1800mg/kg,主要含有腐胺和酪胺;添加肺炎克雷伯氏菌和白吉利絲孢酵母后,總胺含量略有增加,達(dá)到2100mg/kg,尸胺含量增加;添加植物乳桿菌后,酪胺含量降低,總胺含量為1000mg/kg。TaoTang等對成品腐乳中總胺含量進(jìn)行檢測,微生物發(fā)酵腐乳中總胺含量為129.0mg/kg,酶制腐乳中總胺含量為137.7mg/kg。相比之下,前酵結(jié)束時,總胺含量相對較高。在雅致放射毛霉發(fā)酵過程中,色胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺含量變化呈現(xiàn)較平緩的趨勢,均在50mg/kg以下;β-苯乙胺的含量在發(fā)酵36h內(nèi)呈上升趨勢,36h以后含量逐漸下降。而尸胺和酪胺含量較高,且在發(fā)酵36h之后含量迅速增加(見圖5)。少孢根霉發(fā)酵36h后,酪胺含量迅速增加,占總胺含量的大部分,其余7種生物胺含量變化不大,且含量均在50mg/kg以下(見圖6)。在腐乳的前酵過程中,主要是微生物在白坯上生長繁殖并分泌酶,使大分子降解成小分子。從以上數(shù)據(jù)可以看出,在前酵過程中,蛋白質(zhì)經(jīng)過不同程度的降解生成了相對較小的多肽和氨基酸,并且多肽和氨基酸的含量隨發(fā)酵時間的延長不斷增加。全明海研究了雅致放射毛霉發(fā)酵腐乳中蛋白酶活力的變化,0~12h蛋白酶活力增長很慢,12~36h呈線性迅速增加,36~48h增長速度有所下降,但仍呈上升趨勢。這與雅致放射毛霉前酵過程中多肽含量的變化趨勢相一致,但多肽含量的增加相對蛋白酶活有一定的滯后性,多肽含量在24~48h增長較快,48h后仍呈增長趨勢,但增速較慢。多肽進(jìn)一步分解為小分子的氨基酸,氨基態(tài)氮含量一直呈上升趨勢,且雅致放射毛霉發(fā)酵產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量一直高于少孢根霉發(fā)酵的產(chǎn)物,并與生物胺總量的變化趨勢一致,這與LuYongmei等的研究結(jié)果一致。LuYongmei等針對40種不同發(fā)酵方式的醬油中生物胺含量進(jìn)行了檢測,氨基態(tài)氮含量高的樣品中總胺含量也相應(yīng)較高。Andic等人對HerbyCheese中的生物胺進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)干酪中含氮物質(zhì)的含量與生物胺的含量之間具有相關(guān)性,水溶性蛋白、三氯乙酸溶解性蛋白和磷鎢酸溶解性蛋白含量高的樣品中,生物胺含量高,水溶性蛋白與苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺的含量呈正相關(guān)。生物胺通常是游離氨基酸脫羧產(chǎn)生的,即氨基酸脫去α-羧基形成的,食品中主要的生物胺色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺分別由其相應(yīng)的前體氨基酸色氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸脫羧形成。在腐乳前酵過程中,通過微生物的作用,蛋白質(zhì)不斷降解,小分子含氮物質(zhì)多肽和氨基酸含量增加,為生物胺的形成提供了前體物質(zhì),這從一定程度上解釋了氨基態(tài)氮和生物胺變化趨勢的一致性。3不同微生物對其生物量的影響雅致放射毛霉和少孢根霉在腐乳前酵過程中,多肽、氨基態(tài)氮及生物胺的含