植物染色質(zhì)結(jié)合蛋白和dna的時(shí)空結(jié)合關(guān)系研究

植物染色質(zhì)結(jié)合蛋白和dna的時(shí)空結(jié)合關(guān)系研究

水體的dna不是唯一一個(gè)單獨(dú)分離的。它的穩(wěn)定和功能取決于蛋白質(zhì)結(jié)合形成的綜合體的結(jié)合。DNA結(jié)合蛋白包括組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白。大約165個(gè)堿基對(duì)的DNA纏繞在H2A、H2B、H3和H4組成的組蛋白八聚體上,構(gòu)成染色質(zhì)的基本單元核小體。核小體長(zhǎng)鏈經(jīng)過(guò)復(fù)雜的折疊形成了具有高度螺旋化結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)。DNA埋藏在這個(gè)高度緊縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定存在。生物體感受細(xì)胞外信號(hào),快速進(jìn)行一系列的生化反應(yīng),如基因轉(zhuǎn)錄、基因活化、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)。這些生理生化過(guò)程中染色質(zhì)不斷通過(guò)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化解螺旋,釋放出的DNA雙鏈與不同的蛋白或蛋白復(fù)合體結(jié)合,在這些蛋白的協(xié)同作用下完成生物體的各種調(diào)控。研究表明,DNA與組蛋白的結(jié)合關(guān)系對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化有重要作用,功能蛋白或蛋白復(fù)合體與DNA特異區(qū)域的結(jié)合直接調(diào)控了基因的表達(dá),例如:RNApolymeraseII與基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,啟動(dòng)了基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程;DRM2識(shí)別重復(fù)序列的DNA,并與其結(jié)合使胸腺嘧啶甲基化,沉默了該基因。環(huán)境因子、發(fā)育信號(hào)等如何調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。這些研究都需要分析參與基因表達(dá)調(diào)控的DNA元件和特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。因此,研究DNA與蛋白之間的結(jié)合關(guān)系對(duì)探索復(fù)雜的生命活動(dòng)有重要意義。目前報(bào)道的DNA與蛋白結(jié)合關(guān)系的研究方法主要有:根據(jù)裸露的DNA和DNA-蛋白復(fù)合體在電場(chǎng)中遷移率的不同而設(shè)計(jì)的凝膠阻滯檢測(cè)方法;根據(jù)DNA-蛋白復(fù)合體中DNA受保護(hù)而不被DNaseI切割原理設(shè)計(jì)的DNA足跡檢測(cè)方法;硫酸二甲酯特異甲基化修飾裸露DNA的鳥(niǎo)嘌呤,六氫吡啶識(shí)別并切割這種修飾位點(diǎn),依據(jù)這個(gè)原理設(shè)計(jì)的DNA甲基化干擾試驗(yàn)方法。這3種方法有一個(gè)共同的不足之處———均為體外檢測(cè)方法,考慮到這些試驗(yàn)結(jié)果是否能反映生物體內(nèi)真實(shí)的生命過(guò)程,分子生物學(xué)家依據(jù)抗原抗體的特異結(jié)合原理,設(shè)計(jì)了染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)方法,即在染色質(zhì)環(huán)境下研究染色質(zhì)結(jié)合蛋白與DNA之間相互關(guān)系的技術(shù)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)CpG甲基化的維持依賴(lài)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(MET1),在突變體met1中CpG甲基化大量減少,有研究表明,異染色質(zhì)區(qū)轉(zhuǎn)座子At4g03870的組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸的甲基化與CpG甲基化互相依賴(lài),Tariq等通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀的方法研究了野生型Col-0和突變體met1中組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸甲基化的差異。本研究將以擬南芥野生型Col-0和突變體met1為研究對(duì)象,重復(fù)Tariq等的試驗(yàn)結(jié)果,并且結(jié)合已報(bào)道的技術(shù)資料,修改并完善了試驗(yàn)方法,從6個(gè)方面詳細(xì)描述試驗(yàn)步驟(圖1),并為單個(gè)基因與蛋白結(jié)合關(guān)系的研究和特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)的全基因組學(xué)研究推薦方法,供分子生物學(xué)研究者交流使用。1材料和方法1.1植物材料將在土中生長(zhǎng)3周的擬南芥野生型Col-0和突變體met1的幼嫩葉片在液氮中收集凍存,待用。1.2領(lǐng)導(dǎo)人的測(cè)定、蛋白質(zhì)和dna的結(jié)合1.2.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.2.2樣品的制備和分離液氮提核:每個(gè)樣品取0.5g植物材料于液氮中充分研磨,倒入有8mL提核緩沖液M1的15mL離心管中,快速上下顛倒數(shù)次混勻。本試驗(yàn)共分兩組,第1組,4個(gè)野生型Col-0,用于檢測(cè)適宜的超聲條件;第2組,一個(gè)野生型Col-0和突變體met1,用于免疫共沉淀試驗(yàn)。蛋白和DNA的甲醛交聯(lián):在上述已混勻的樣品中均加入216μL37%的甲醛(終濃度為1%),置于4℃冷室緩慢搖晃孵育10min。中和甲醛,終止交聯(lián):每個(gè)已交聯(lián)的樣品中加入543μL2mol·L-1的甘氨酸(終濃度為0.125mol·L-1),置于4℃冷室搖晃孵育5min。除去未研磨充分的植物殘?jiān)?在漏斗中鋪設(shè)4層濾膜,過(guò)濾上述溶液到新標(biāo)記的15mL離心管中。分離得到細(xì)胞核:12000r·min-1,4℃,離心10min,棄上清液。12000r·min-1離心時(shí)細(xì)胞核因?yàn)楸戎剌^大會(huì)沉淀,而其他的植物組織位于上清液中,棄上清可以得到相對(duì)純凈的細(xì)胞核。清洗細(xì)胞核:用冰浴的1mLM2緩沖液吹吸混勻沉淀,轉(zhuǎn)入1個(gè)1.5mL離心管中,13200r·min-1,4℃,離心1min,棄上清洗細(xì)胞核。再用1mL的M2緩沖液吹吸清洗,離心,棄上清,重復(fù)兩次。最后一次離心后小心地除去所有的上清,沉淀用1mLM3緩沖液吹吸混勻。至此得到大量完整相對(duì)干凈,蛋白和DNA交聯(lián)的細(xì)胞核。1.3超聲破碎1.3.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.3.2超聲效率的檢測(cè)細(xì)胞核膜裂解:將溶解于M3緩沖液中的細(xì)胞核,13200r·min-1離心1min,去上清,每個(gè)樣品用300μL核裂解和超聲緩沖液吹吸混勻細(xì)胞核顆粒。細(xì)胞核裂解和超聲緩沖液中1%的SDS會(huì)將細(xì)胞核膜裂解,至此染色質(zhì)完全暴露。超聲打斷染色質(zhì):超聲波打斷染色質(zhì),是染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)的關(guān)鍵步驟,染色質(zhì)片段過(guò)大會(huì)嚴(yán)重降低共沉淀效率,而過(guò)小的片段使PCR難于檢測(cè)。由于不同的超聲波破碎儀,功率完全不同,因此初次試驗(yàn)必須做超聲功率,超聲時(shí)間和超聲次數(shù)的梯度試驗(yàn)。本試驗(yàn)使用的是新芝JY92-IIN型超聲破粉碎機(jī)。第1組4個(gè)野生型Col-0用于檢測(cè)超聲效率。每個(gè)野生型取出10μL混合,作為超聲前基因組對(duì)照,每個(gè)野生型再分別取出10μL作為上樣量對(duì)照,將兩個(gè)野生型Col已裂解的細(xì)胞核分別用12%和15%功率超聲5s,置于冰上間隔20s,共超聲11次。為保證檢測(cè)的超聲條件穩(wěn)定,另外兩個(gè)野生型Col已裂解的細(xì)胞核同樣功率重復(fù)超聲一次。將超聲樣品和超聲前基因組對(duì)照,上樣量對(duì)照一起用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)超聲效率。在適宜的超聲條件下,將第2組一個(gè)野生型Col-0和突變體met1,進(jìn)行超聲。獲得打斷的染色質(zhì):將第2組的超聲溶液13200r·min-1、4℃離心5min。上清為打斷的染色質(zhì),沉淀為植物組織破碎的雜質(zhì),取上清。取對(duì)照標(biāo)準(zhǔn):在染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)中,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)起內(nèi)參作用,蛋白結(jié)合的DNA量是根據(jù)占總DNA含量的百分比來(lái)相對(duì)定量。每個(gè)樣品取10μL作為總DNA對(duì)照,標(biāo)記Col-input,met1-input放置于-20℃待用。1.4抗感染的結(jié)合反應(yīng)1.4.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.4.2proinaagaruse-met1-no生物不良反應(yīng)檢測(cè)稀釋樣品:將上述含有細(xì)胞核裂解液的染色質(zhì)溶液用CHIP緩沖液稀釋至3mL待用。清洗ProteinAAgarousebeads:為防止beads受損,每個(gè)樣品用去尖端的槍頭吸取120μLproteinAAgarousebeads分裝入兩個(gè)1.5mL的離心管中,分別用1mLCHIP緩沖液清洗,2000r·min-1離心,去上清,重復(fù)清洗3次。將上述待用的3mL溶液,加入已清洗的ProteinAAgarousebeads管中,每管1.5mL,一管標(biāo)記抗體,另一管標(biāo)記非抗體。例如,本試驗(yàn)標(biāo)記Col-antibody,Col-noanti-body;met1-antibody,met1-noantibody。預(yù)處理:將含有ProteinAAgarousebeads的染色質(zhì)溶液在4℃冷室緩慢搖晃孵育1h,把染色質(zhì)溶液中可以結(jié)合ProteinAAgarousebeads的物質(zhì)去除,防止非特異性結(jié)合,提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,類(lèi)似westernblot和northernblot的預(yù)雜。10000r·min-1,4℃,離心2min,取上清。抗原抗體結(jié)合反應(yīng):每個(gè)樣品,在抗體管加入10μLanti-H3K9Me抗體,另一管非抗體管不加抗體。所有的樣品同時(shí)置于4℃冷室,緩慢搖晃孵育過(guò)夜。在孵育過(guò)程中,抗體會(huì)特異結(jié)合到抗原蛋白上,抗原蛋白交聯(lián)著目的DNA片段,用來(lái)研究蛋白和DNA之間的結(jié)合關(guān)系。1.5共染色免疫沉淀1.5.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.5.2大、中、細(xì)共沉淀:每個(gè)處理加入75μL用CHIP緩沖液清洗的proteinAAgarousebeads,在4℃冷室緩慢搖晃孵育1h。這時(shí)proteinAAgarousebeads會(huì)特異結(jié)合抗體。2000r·min-1、4℃離心1min,離心使beads結(jié)合的抗體,抗原蛋白和交聯(lián)的DNA一起沉淀,棄上清,保留beads。去除非特異性結(jié)合:1)低鹽緩沖液清洗,用低鹽緩沖液清洗beads兩次,第1次每管加入1mL緩沖液,緩慢搖晃混勻,立即在4℃2000r·min-1離心1min,棄上清;第2次每管加入1mL緩沖液,緩慢搖晃混勻5min,4℃2000r·min-1離心1min,棄上清。2)高鹽緩沖液清洗,兩次清洗方法同低鹽緩沖液。3)氯化鋰緩沖液清洗:兩次清洗方法同低鹽緩沖液。4)TE緩沖液清洗:兩次清洗方法同低鹽緩沖液。解交聯(lián):加入250μL新配置的Elution緩沖液,搖晃混勻,65℃15min2000r·min-1離心1min,小心地將上清轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中,重復(fù)一次,獲得約500μL蛋白和交聯(lián)的DNA溶液。此時(shí),蛋白質(zhì)和其交聯(lián)的DNA,溶解于Elution緩沖液中。從-20℃取出待用的10μL參照標(biāo)準(zhǔn),用Elution緩沖液補(bǔ)體積至500μL,同時(shí)與樣品解交聯(lián)。在所有處理溶液中加入20μL5mol·L-1氯化鈉溶液,65℃靜置6~8h,交聯(lián)的蛋白和DNA將解交聯(lián)。1.6純度dna1.6.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.6.2殘留rna的rnasea消化蛋白和RNA:在解交聯(lián)的溶液中加入31.5μL蛋白消化液,45℃靜置孵育1h。然后每管加入10μL2μg·μL-1的RNaseA,室溫孵育30min消化體系中殘留的RNA。純化DNA:每管加入2.5mLPB緩沖液和50μL3mol·L-1乙酸鈉,乙酸鈉用于幫助沉淀DNA,PB緩沖液將DNA結(jié)合到柱子上,按Qiagenspinminiprep試劑盒說(shuō)明純化DNA,100μLEB緩沖液溶解DNA。1.7測(cè)試1.7.1準(zhǔn)備考試前的準(zhǔn)備工作1.7.2pcr檢測(cè)染色基因組陽(yáng)性對(duì)照,Col-noantibody和met1-noanti-body作為陰性對(duì)照,Col-antibody和met1-antibod-y為樣品。按20μL半定量PCR體系(10×PCRbuffer2μL,dNTP1μL,正向引物0.2μL,反向引物0.2μL,DNA1μL,Taq酶0.25μL,ddH2O至20μL)加樣,做半定量PCR,然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。正向引物和反向引物可以設(shè)計(jì)在蛋白與基因組結(jié)合的任意位點(diǎn)。本試驗(yàn)參照Tariq等的研究,選擇正向引物Actin2/7F:ATGGAATCCATCGC-CAGCTTCAC,反向引物Actin2/7R:CGCGAGG-TAGATCGATACATTCC來(lái)檢測(cè)染色質(zhì)免疫共沉淀效率。選擇正向引物At4g03870F:ATGAAGG-GAGCTTCGATAGAGGAGG,反向引物At4g03870R:TAGACTCTTCATCCCCGTCACTCGC來(lái)檢測(cè)使用本研究提出的染色質(zhì)免疫共沉淀方法是否能得到與已報(bào)道的結(jié)果趨勢(shì)相同。1.8col-/met1-對(duì)抗投料回復(fù)突變體的檢測(cè)對(duì)于蛋白和目的基因之間結(jié)合關(guān)系的研究,可以通過(guò)real-timePCR來(lái)相對(duì)定量分析。Col-input和met1-input為基因組陽(yáng)性對(duì)照,Col-noantibody和met1-noantibody作為陰性對(duì)照,Col-antibody和met1-antibody樣品之間相互比較分析差異。采用ABIPrism7500定量PCR儀和TransStartGreenqPCRSuperMix試劑盒,定量分析比較了野生型Col和突變體met1中轉(zhuǎn)座子At4g03870H3K9甲基化的差異,得到了與Tariq等趨勢(shì)相同的結(jié)果。針對(duì)不同的Real-timePCR儀,應(yīng)使用對(duì)應(yīng)的qPCR試劑盒,例如BioRadCFX96,一般推薦使用SYBRGreenERSupermix,ABIPrism7500和TransStartGreenqPCRSuperMix。PCR程序和體系,參照qPCR試劑盒的說(shuō)明。1.9全基因組研究蛋白質(zhì)結(jié)合DNA的全基因組研究。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)構(gòu)建的全基因組文庫(kù),來(lái)研究蛋白質(zhì)-基因組的特異性結(jié)合,已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因調(diào)控和蛋白質(zhì)功能學(xué)研究,這一技術(shù)對(duì)遺傳發(fā)育與表觀遺傳具有很重要的意義。當(dāng)前已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了染色質(zhì)免疫共沉淀的全基因組文庫(kù)構(gòu)建和分析的方法。本研究推薦使用illu-mina商品化的PreparingSamplesforCHIPSe-quencingofDNA試劑盒構(gòu)建全基因組文庫(kù),采用Volouev等報(bào)道的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果與分析2.1超聲產(chǎn)物的擴(kuò)增染色體的超聲產(chǎn)物對(duì)染色質(zhì)免疫共沉淀是非常重要的(圖1),產(chǎn)物片段太小不利于定量分析時(shí)引物的設(shè)計(jì),太大則影響免疫共沉淀并造成定量分析時(shí)大量的假陽(yáng)性。研究表明超聲產(chǎn)物的片段以200~800bp為宜。本研究用新芝JY92-IIN型超聲破粉碎機(jī)12%和15%功率,對(duì)野生型Col-0分別超聲11次,檢測(cè)適宜的超聲條件。圖2中A為超聲前基因組,DNA>10kb,說(shuō)明超聲前作為對(duì)照的基因組是完整的;圖2中B為15%功率超聲11次后的產(chǎn)物,E為它的生物學(xué)重復(fù);C為12%功率超聲11次后的超聲產(chǎn)物,D為它的生物學(xué)重復(fù);b、c、d和e分別為對(duì)應(yīng)B、C、D和E的上樣量對(duì)照。本研究結(jié)果表明,12%功率超聲11次后,超聲產(chǎn)物大部分處于300~500bp(圖2);15%功率超聲11次后,雖然超聲產(chǎn)物在300~500bp出現(xiàn)了明顯的條帶,但相對(duì)于12%功率產(chǎn)物,表現(xiàn)為過(guò)超聲狀況,即超聲產(chǎn)物沒(méi)有在200~800bp大量出現(xiàn)。相同的上樣量對(duì)照說(shuō)明4個(gè)野生型Col-0的超聲前產(chǎn)物中基因組DNA的含量是均等的,15%功率超聲后產(chǎn)物和12%相比(圖2),發(fā)現(xiàn)在過(guò)超聲條件下過(guò)小的超聲片段在電泳中以極快的速度遷移出瓊脂糖凝膠,從而獲得較少的適宜產(chǎn)物,這樣的產(chǎn)物會(huì)影響定量分析。研究表明,新芝JY92-IIN型超聲破粉碎機(jī),12%功率超聲11次后,超聲產(chǎn)物達(dá)到了染色質(zhì)免疫共沉淀的要求,并且生物學(xué)重復(fù)穩(wěn)定可靠。建議染色質(zhì)免疫共沉淀研究者,初次試驗(yàn)時(shí)必須參照超聲破粉碎機(jī)的說(shuō)明,摸索超聲功率,超聲時(shí)間和超聲次數(shù)的條件,以便超聲產(chǎn)物達(dá)到染色質(zhì)免疫共沉淀的要求。2.2pcr擴(kuò)增效果經(jīng)過(guò)5個(gè)部分的連續(xù)操作,第2組材料最終獲得了與蛋白結(jié)合的DNA片段。如何檢測(cè)染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)是否成功,結(jié)合大量的報(bào)道,本研究提出了低成本的半定量RCR檢測(cè)方法。其檢測(cè)結(jié)果表明,陽(yáng)性對(duì)照Col-input和met1-input均出現(xiàn)明顯條帶,這說(shuō)明半定量PCR系統(tǒng)工作良好,沒(méi)有出現(xiàn)引物二聚體,說(shuō)明引物設(shè)計(jì)完美(用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)比分析結(jié)果時(shí)引物二聚體的擴(kuò)增會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果)。樣品條帶(圖3Col-antibody和met1-antibod-y)與陰性對(duì)照(圖3Col-noantibody和met1-noan-tibody)差異明顯,說(shuō)明抗體起到免疫共沉淀作用,體系無(wú)污染。Col-antibody和met1-antibody的差異表明,在突變體met1中anti-H3K9Me抗體結(jié)合的DNA量大大減少,即異染色質(zhì)區(qū)轉(zhuǎn)座子At4g03870的組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸的甲基化顯著減少,試驗(yàn)結(jié)果與Tariq等的報(bào)道一致,通過(guò)定量PCR所得的結(jié)果與Tariq等的報(bào)道趨勢(shì)一致(圖4),說(shuō)明本研究提出的染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)方法是可行的。成功的免疫共沉淀產(chǎn)物可用來(lái)做更多目的基因的定量分析和蛋白質(zhì)結(jié)合DNA的全基因組研究。3半定量pcr法檢測(cè)染色質(zhì)免疫共沉淀植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng),都依賴(lài)相關(guān)基因的時(shí)空調(diào)控,蛋白質(zhì)無(wú)疑在這一調(diào)控過(guò)程中起主要作用。蛋白質(zhì)對(duì)基因的調(diào)控需要與染色質(zhì)結(jié)合,然后啟動(dòng)或關(guān)閉基因的轉(zhuǎn)錄。研究蛋白質(zhì)和DNA的相互關(guān)系是從機(jī)制上研究基因調(diào)控的手段。染色質(zhì)免疫共沉淀正是在體內(nèi)研究染色質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)DNA的有效方法,本研究提出的試驗(yàn)方法不僅可用來(lái)做目的基因的定量分析,而且適用于構(gòu)建特異蛋白的全基因組結(jié)合圖譜。Bowler等用1.5g擬南芥材料起始,利用先交聯(lián)再提核的方法獲得細(xì)胞核,本研究參照Park等的液氮提核方法,修改簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟,提出了先提核再交聯(lián)的方法,提高了提核效率,將初始材料減少至0.5g,方便珍貴植物材料的研究。甲醛廣泛應(yīng)用于體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),本研究參照Orlando和Paro及Kuo和Allis提供的甲醛共價(jià)交聯(lián)方法,交聯(lián)牢固又方便廉價(jià),而不是部分研究使用的UV交聯(lián),避免了整個(gè)植物組織交聯(lián)不充分的缺點(diǎn)。對(duì)影響染色質(zhì)免疫共沉淀最重要的超聲破碎部分做了詳細(xì)地說(shuō)明,為科研工作者提供了方法和建議,避免因超聲產(chǎn)物不合格而浪費(fèi)昂貴的抗體。研究表明,鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)合非常重要,梯度鹽溶液清洗,能夠洗脫非特異性結(jié)合。TE緩沖液用于清洗和中和體系中大量的高濃度鹽離子。參照Bowler的方法,同一清洗緩沖液,本研究進(jìn)行了兩次不同的清洗,以充分去除非特異性結(jié)合。本研究提出的半定量PCR法檢測(cè)染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn),可以直接從膠圖結(jié)果看到體系中抗體是否起到免疫共沉淀作用,體系有無(wú)污染,而不用通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)分析。用擬南芥野生型Col-0和突變體met1,H3K9Me抗體得到的染色質(zhì)免疫共沉淀產(chǎn)物,半定量檢測(cè)表明染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)成功,定量試驗(yàn)與已報(bào)道的結(jié)果趨勢(shì)一致,這說(shuō)明本研究提出的試驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。配置37%甲醛,2mol·L-1甘氨酸,蛋白酶抑制劑cocktail(1∶500去離子水稀釋),每個(gè)樣品8mL提核緩沖液M1(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mmol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1mol·L-1hexyleneglycol,1∶100加入稀釋好的蛋白酶抑制劑),每個(gè)樣品3mL提核緩沖液M2(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mmol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1mol·L-1hexyleneglycol,10mmol·L-1MgCl2,0.5%Triton-X100,1∶100加入稀釋好的蛋白酶抑制劑),每個(gè)樣品1mL提核緩沖液M3(10mmol·L-1phosphatebuffer,pH7.2,0.1mol·L-1NaCl,10mmol·L-1mercapto-ethanol,1∶100加入稀釋好的蛋白酶抑制劑);預(yù)冷離心機(jī)至4℃,所有操作都應(yīng)于冷室或冰上進(jìn)行,防止蛋白降解。配置核裂解和超聲緩沖液(50mmol·L-1Tris-HC