乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母產(chǎn)輔酶nad

乙醇發(fā)酵過程中釀酒酵母產(chǎn)輔酶nad

nad-（氧化二氧化銨氧化二羧酸）和nadh（還原性二氧化銨氧化二羧酸）是高度氧化、還原和代謝的極重要因素。在酵母細胞內(nèi)NAD+和NADH二者相互轉(zhuǎn)化,同化或異化過程都會導(dǎo)致NAD+被還原為NADH,為維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡,NADH需被重氧化。酵母細胞中存在至少5條NADH重氧化代謝途徑,如乙醇生成途徑,甘油生成途徑等,酵母細胞內(nèi)的NAD+和NADH水平一定程度上決定著細胞內(nèi)的代謝流分布。酵母細胞內(nèi)的NAD+和NADH比例不僅調(diào)節(jié)著氧化還原平衡,而且是細胞的代謝活性指標,在代謝過程及控制上有著極為重要的作用。酵母細胞內(nèi)的NAD+和NADH水平與細胞所處環(huán)境的氧化還原狀態(tài)息息相關(guān),在乙醇發(fā)酵過程中可通過控制胞外氧化還原狀態(tài)來調(diào)節(jié)細胞的生長及產(chǎn)物生成。因此考察乙醇發(fā)酵過程中細胞內(nèi)NAD+和NADH水平對了解細胞代謝有舉足輕重的作用。檢測酵母細胞內(nèi)輔酶NAD+和NADH的關(guān)鍵步驟為:胞內(nèi)輔酶的高效提取及輔酶含量的準確測定。輔酶的提取方法主要有酸堿加熱提取,細胞破碎提取等,針對不同種類不同發(fā)酵體系的細胞提取方法不能通用。關(guān)于釀酒酵母輔酶NAD+和NADH提取方法眾說紛紜,并且輔酶分子自身不夠穩(wěn)定,因此探討乙醇發(fā)酵體系中輔酶的提取方法顯得尤為重要。目前測定微生物細胞內(nèi)NAD+和NADH采用的方法有HPLC、熒光法及酶循環(huán)法。利用HPLC測定輔酶時,樣品處理對測定影響較大,樣品處理過程中積累的鹽離子及發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)對測定均有較大干擾,導(dǎo)致檢測靈敏度降低。熒光法相對成本更高,降低了使用的可能性。酶循環(huán)測定方法反應(yīng)溫和,無污染,靈敏度高且操作簡便。酶循環(huán)法的反應(yīng)原理見圖1。其中ETOH、ALD、PES、MTT和Formazan分別為乙醇、乙醛、吩嗪乙基硫酸鹽、噻唑藍和甲簪。當(dāng)體系中存在以上底物及輔酶NAD+和NADH時,在乙醇脫氫酶(ADH)催化作用下,輔酶參加循環(huán)反應(yīng)直至底物消耗完。反應(yīng)過程中不斷生成藍色的物質(zhì)甲簪(Formazan),從而使體系在570nm下的吸光值不斷發(fā)生變化。在一定溫度及反應(yīng)時間內(nèi),酶反應(yīng)速率與樣品中輔酶濃度呈線性關(guān)系。據(jù)此,通過與標準品的反應(yīng)速率進行對比,能夠準確測得樣品中輔酶的濃度。基于此反應(yīng)原理,作者主要目的在于研究釀酒酵母細胞內(nèi)輔酶NAD+和NADH的提取方法,并建立合適的酶循環(huán)反應(yīng)體系,最終建立一套完善高效的酵母細胞內(nèi)輔酶NAD+和NADH檢測方法。1材料和方法1.1試劑ADH、MTT、PES、Bicine:均購買自Sigma公司;乙醇等其余試劑:均為分析純,購買自國藥集團公司。1.2培養(yǎng)基1.3活菌的培養(yǎng)稱取5g活性干酵母,置于已滅菌的2g/dL的100mL葡萄糖溶液中,于30℃下孵育30min,活菌濃度為2×108CFU/mL。活化后的菌液稀釋至一定的濃度,取100μL涂布在固體培養(yǎng)基上,獲得單菌落,4℃保藏。1.3.2發(fā)酵液培養(yǎng)條件1)一級種子培養(yǎng):從平板上挑取一個單菌落,接入已滅菌的30mL種子培養(yǎng)基中,30℃,200r/min條件下培養(yǎng)16h。2)二級種子培養(yǎng):將培養(yǎng)16h的一級種子液轉(zhuǎn)入120mL種子培養(yǎng)基中,30℃、200r/min條件下培養(yǎng)16h。以10%接種體積分數(shù)接入一級種子液,500mL搖瓶裝液量為150mL,轉(zhuǎn)速200r/min,溫度30℃。以10%接種體積分數(shù)將二級種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,2.5L發(fā)酵罐裝液量1.5L,攪拌轉(zhuǎn)速為250~300r/min,溫度30℃,0~6h通氣0.2vvm。分別于接種后5h和8h取樣一次,每次取3份平行樣品,測定發(fā)酵樣品的生物量及輔酶含量。1.4離心教育,清洗離心取40mL發(fā)酵液置于已知重量干燥的50mL離心管中,10000r/min下離心10min,去上清液,用無菌水清洗,重復(fù)離心操作2遍。置于60℃下烘干至恒重后稱重,每個樣品3個重復(fù),測酵母細胞干重。1.5提取酶的方法1.5.1反復(fù)凍融法提取nad1)方法1:1mL樣品加入300μLHCl(0.4mol/L),50℃加熱10min,冷卻至0℃后用KOH溶液(0.2mol/L)滴定中和,離心(12000r/min,10min,4℃)保留上清液,立即用于酶循環(huán)反應(yīng)測定。2)方法2:注入1mLHClO4溶液中(35g/dL,-20℃),終止細胞代謝。0℃與-20℃間反復(fù)凍融,破壞細胞結(jié)構(gòu)提取NAD+同時破壞NADH,實驗中考察不同的凍融次數(shù)對提取的影響。凍融結(jié)束后冰浴條件下用2mol/LKOH滴定調(diào)節(jié)提取液pH至7.0,離心(12000r/min,10min,4℃)保留上清液,立即用于酶循環(huán)反應(yīng)測定。3)方法3:注入1mLHClO4溶液中(35g/dL;-20℃),終止細胞代謝。加入等體積玻璃珠(D0.5mm),30s振蕩、30s冰浴重復(fù)操作,70℃下保溫7min,破壞細胞及NADH的同時提取NAD+,考察反復(fù)振蕩操作時間對提取的影響。細胞破碎結(jié)束后冰浴條件下用2mol/LKOH滴定調(diào)節(jié)提取液pH至7.0,離心(12000r/min,10min,4℃)保留上清液,進行酶循環(huán)反應(yīng)測定。1.5.2體外酶循環(huán)反應(yīng)1)方法1:1mL樣品加入300μLKOH(0.4mol/L),50℃加熱10min,冷卻至0℃后用HCl(0.2mol/L)滴定中和至pH7.0,離心(12000r/min,10min,4℃)保留上清液,立即進行酶循環(huán)反應(yīng)測定。2)方法2:3mL樣品注入1mL2mol/LKOH乙醇(體積分數(shù)50%;-20℃)溶液中,終止細胞代謝。70℃加熱7min,冷卻至0℃后用HCl(1mol/L)滴定中和,離心(12000r/min,10min,4℃)保留上清液,立即進入酶循環(huán)反應(yīng)。3)方法3:3mL樣品注入1mL2mol/LKOH乙醇(體積分數(shù)50%;-20℃)溶液中,終止細胞代謝。加入等體積玻璃珠(D0.5mm),30s振蕩、30s冰浴重復(fù)操作8次,70℃保溫7min,破壞細胞及NAD+的同時提取NADH。冰浴條件下用HCl(1mol/L)滴定提取液pH7.0,離心保留上清液,立即酶循環(huán)反應(yīng)進行測定。2結(jié)果與討論2.1體系2反應(yīng)動力學(xué)過程現(xiàn)有文獻報道中所使用的酶循環(huán)法反應(yīng)體系各有不同,實驗中以標準品NAD+反應(yīng)速率為指標考查2種不同的反應(yīng)體系,從而確立較為合適的酶循環(huán)反應(yīng)體系。2種體系的組成成分及規(guī)格見表1,其中乙醇脫氫酶最后加入以啟動反應(yīng)。不同反應(yīng)體系下測定NAD+標準品的反應(yīng)速率。結(jié)果表明:體系1反應(yīng)速度快,體系2相對較慢。NAD+標準品濃度范圍為0.01~0.04mmol/L,體系1條件下的反應(yīng)動力學(xué)過程見圖2。該體系條件下反應(yīng)迅速,2~3min內(nèi)吸光值超過有效測定范圍,得到的輔酶濃度與反應(yīng)速率標準曲線為:y=4.5056x-0.005(R2=0.9832)。其中相關(guān)系數(shù)R2較低,可能由于過快的反應(yīng)速度導(dǎo)致較大的測定誤差。體系2實驗結(jié)果表明,體系2中酶反應(yīng)速率較低,15min內(nèi)仍能保持反應(yīng)速率穩(wěn)定,吸光值與時間呈良好的線性關(guān)系且吸光值未超過有效的測定范圍。如圖3所示,當(dāng)標品濃度為0.04mmol/L時,反應(yīng)速率僅為0.0022(ΔA570nm/ΔS)。然而在反應(yīng)體系1條件下,當(dāng)標品濃度為0.01mmol/L時,反應(yīng)速率已經(jīng)達到0.003(ΔA570nm/ΔS)。由體系2得到的NAD+標準曲線為y=0.3183x-0.0008(R2=0.9966),相關(guān)系數(shù)高。因此酶循環(huán)反應(yīng)體系2更加適合于輔酶濃度的測定,可減小測量誤差,使檢測結(jié)果準確率更高。2.2珠磨破碎細胞的酶活性NAD+在酸性條件下穩(wěn)定,酸的水溶液可用于提取生物細胞內(nèi)輔酶NAD。作者主要考察乙醇發(fā)酵中釀酒酵母細胞輔酶NAD+的3種提取方法。方法1處理樣品的酶循環(huán)反應(yīng)速率為0,說明單純加鹽酸加熱方法不能有效提取出真菌酵母細胞的輔酶。可能由于提取體系中的鹽酸不能有效增加細胞膜的通透性,不足以破壞釀酒酵母的細胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致提取失敗,因此鹽酸不適合于酵母細胞內(nèi)氧化型輔酶的提取。方法2分別進行3組實驗考察不同的凍融次數(shù)對輔酶NAD+提取的影響,不同凍融次數(shù)下細胞破碎程度可能有差別。凍融次數(shù)分別為1次,2次,3次,樣品反應(yīng)速率結(jié)果見圖4。由圖4可知,凍融一次的樣品酶循環(huán)反應(yīng)速率為0,即未能提取出胞內(nèi)的NAD+。凍融2次與3次處理的樣品酶反應(yīng)速率相似,表明凍融2次就可以高效的破碎細胞,提取胞內(nèi)的NAD+。對照標準曲線得到的輔酶濃度見表2。方法3主要探討了振蕩時間對提取NAD+的影響,不同的振蕩時間可能會對細胞破碎率產(chǎn)生影響。30s振蕩、30s冰浴反復(fù)間歇操作分別為8、10、13次,即破碎時間分別為8、10、13min,處理后樣品所測定的輔酶的反應(yīng)動力學(xué)如圖5。由圖5可知,8~13min處理的樣品測定反應(yīng)速率一致,表明8min已經(jīng)能夠完全破碎酵母細胞并有效提取酵母細胞內(nèi)的輔酶NAD+。運用方法2與方法3提取相同樣品的細胞內(nèi)輔酶,濃度測定結(jié)果見表2。珠磨破碎法處理的樣品濃度(0.0059mmol/g)(以DCW計)要稍高于凍融循環(huán)破碎法處理樣品的濃度(0.0048mmol/g)(以DCW計),表明珠磨破碎法能夠更高效的提取胞內(nèi)輔酶NAD+。并且珠磨破碎輔助加高氯酸加熱提取方法處理樣品的總時間僅15min,而反復(fù)凍融法至少需要2h,較長的操作時間內(nèi)環(huán)境因素可能會導(dǎo)致氧化還原型輔酶的相互轉(zhuǎn)化及輔酶的降解,因此方法3有效避免了長時間操作帶來的不利影響并且操作簡便。方法3中設(shè)計了標準品的對照組實驗,其中0.020mmol/LNAD+標準品經(jīng)過相同提取條件處理后測定濃度為0.020mmol/L(實驗重復(fù)3次,標準偏差為±0.001),0.020mmol/LNADH標準品經(jīng)過相同提取條件酸處理后酶循環(huán)反應(yīng)速率幾乎為零,即提取過程不會造成輔酶NAD+的損失并能完全破壞NADH,從而實現(xiàn)了輔酶NAD+的高效檢測。實驗結(jié)果表明,珠磨破碎細胞輔助加高氯酸方法能夠有效提取乙醇發(fā)酵樣品中釀酒酵母細胞的輔酶NAD+。NADH在堿性條件下穩(wěn)定,利用堿溶液可提取胞內(nèi)NADH,在已有文獻報道基礎(chǔ)上,作者考察了輔酶NADH樣品的3種處理方法。方法1處理的樣品進行酶反應(yīng)速率為0,即利用堿的水溶液加熱提取酵母胞內(nèi)NADH不可行。該方法不足以破壞酵母細胞結(jié)構(gòu),不能增加細胞膜的通透性,從而無法有效地提取出輔酶NADH。方法2中KOH溶液中含有乙醇,能夠破壞酵母細胞膜增加膜通透性,因此輔以加熱可能會得到較為理想的結(jié)果。作者考察堿溶液用量與樣品的比例(由1∶3增加至1∶1),對輔酶NADH提取的影響以及不同處理方法測定的酶反應(yīng)動力學(xué)見圖6。由于KOH濃度的差異,中和時加入的酸量不同,導(dǎo)致樣品的稀釋率有所不同,樣品中細胞干重為5.6g/L。當(dāng)KOH與樣品比例為1∶3時,測得NADH濃度為0.008mmol/g(以DCW計);而KOH與樣品比例為1∶1時,測定樣品中NADH為0.0064mmol/g(以DCW計)。當(dāng)KOH與樣品比例為1:3時已經(jīng)能夠有效的提取胞內(nèi)的輔酶,KOH濃度過大反而不利于胞內(nèi)NADH的提取,這可能與NADH的不穩(wěn)定性有關(guān)。按照方法3提取樣品進行酶循環(huán)反應(yīng)測定,得到胞內(nèi)的NADH摩爾質(zhì)量為0.009mmol/g(以DCW計)。比較以上3種方法可見,方法3最適合胞內(nèi)輔酶NADH的測定。而0.02mmol/L標準品對照實驗同樣表明方法3能較完全的提取輔酶NADH,并有效破壞氧化型輔酶(NAD+)。這種胞內(nèi)NADH提取方法與NAD+提取方法采用相同的物理輔助破碎方法,達到相同的細胞破碎效率,可以有效減小提取過程中的系統(tǒng)誤差。至此建立了完整且高效的檢測乙醇發(fā)酵中酵母細胞內(nèi)的輔酶NAD+及NADH的方法。進一步利用這套方法測定2.5L乙醇發(fā)酵體系中釀酒酵母輔酶的濃度,考察不同胞外氧化還原狀態(tài)下胞內(nèi)的輔酶水平。2.2.3不同氧化還原條件下釀酒酵母細胞內(nèi)還原型氧化酶的變化酶循環(huán)反應(yīng)NAD+及NADH的標準曲線分別為:不同ORP水平下胞內(nèi)NAD+及NADH濃度見表3。NAD+及NADH濃度與文獻處于相近水平。結(jié)果顯示:不同氧化還原狀態(tài)下釀酒酵母NAD+及NADH總量沒有顯著差異,但氧化型與還原型輔酶的比例卻有所不同。停止通氧后,酵母細胞內(nèi)還原型輔酶濃度相對增多,而氧化型輔酶濃度減少,表明此時細胞處于相對還原的的狀態(tài)。不同氧化還原狀態(tài)下實驗結(jié)果進一步表明,作者建立的釀酒酵母細胞NAD+及NADH濃度測定方法是可行的。這套提取方法為分析乙醇發(fā)酵體系中細胞代謝情況提供了方法上的保障,也為深入探討氧化還原電位控制對于乙醇發(fā)酵影響提供了基礎(chǔ)。3方法的可行性、準確性及相對重要性作者通過考察兩種酶循環(huán)反應(yīng)體系下輔酶的反應(yīng)速率,確定體系2可提供合適的反應(yīng)速率,使輔酶的酶循環(huán)法測定更加精確。通過對酸堿加熱提取、反復(fù)凍融破碎提取及珠磨破碎提取方法的研究,表明珠磨破碎8min、輔助加酸/堿加熱處理7min提取酵母細胞胞內(nèi)輔酶的方法簡便易行,快速且準確。同時,2.5L發(fā)酵罐乙醇發(fā)酵體系中的測定結(jié)果進一步肯定了方法的可行性和準確性。作者所建立的NAD+和NADH高效提取、準確測定方法為分析乙醇發(fā)酵體系中酵母細胞胞內(nèi)代謝水平提供了方法上的保障。y=0.3682x-0.021(R2=0.9941),其中x為樣品酶反應(yīng)速率(ΔA570nm/ΔS),y為輔酶濃度(mmol/L)。y=0.3769x-0.0002(R2=0.9975),其中x為樣品酶反應(yīng)速率(ΔA570nm/ΔS),y為輔酶濃度(mmol/L)。1.3.1細菌的激活和保護1.3.3活塞鎖發(fā)酵條件1.3.425kg生育池栽培條件2.2.1nad-mod提取方法2.2.2酵母細胞生物量和胞外氧化還原電位測定為探