外周受力系統(tǒng)在情緒應(yīng)激條件下的作用

外周受力系統(tǒng)在情緒應(yīng)激條件下的作用

國內(nèi)外的研究表明，這種適應(yīng)可以影響動物和人類的免疫功能。而有關(guān)應(yīng)激免疫調(diào)節(jié)作用的機制卻一直是各國學(xué)者不斷探索的課題。隨著研究的深入,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)應(yīng)激的作用機制極其復(fù)雜,涉及下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)、交感神經(jīng)系統(tǒng)、垂體激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)肽類及阿片肽類物質(zhì)的活性,其中主要是HPA軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)。以往的研究認(rèn)為HPA軸是應(yīng)激免疫調(diào)節(jié)作用的主要機制,糖皮質(zhì)激素是其唯一的調(diào)節(jié)介質(zhì)。例如Lysle等觀察到淋巴細(xì)胞的有絲分裂原反應(yīng)降低與源于各種應(yīng)激環(huán)境下的糖皮質(zhì)激素水平相關(guān);Tarcic等發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素對束縛應(yīng)激所誘發(fā)的胸腺退化和萎縮發(fā)揮特異性作用。然而,近年來越來越多的資料表明,交感神經(jīng)系統(tǒng)活性與應(yīng)激免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。首先,解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中樞(骨髓和胸腺)和外周(脾和淋巴結(jié))淋巴器官上均存在直接的交感神經(jīng)纖維支配,且淋巴細(xì)胞膜上存在α和β腎上腺素能受體;其次,人類和動物研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類物質(zhì)(腎上腺素和去甲腎上腺素)能影響T和B淋巴細(xì)胞活性;最后,動物應(yīng)激實驗結(jié)果同樣提示交感神經(jīng)系統(tǒng)參與了應(yīng)激的免疫調(diào)節(jié)作用。例如,Platzer等的研究證實,兒茶酚胺直接參與了應(yīng)激條件下的免疫抑制作用;Naysmith等的研究表明,外周腎上腺素能受體阻斷劑nadolol能逆轉(zhuǎn)由應(yīng)激引起的脾淋巴細(xì)胞有絲分裂原反應(yīng)降低。因此,目前交感神經(jīng)系統(tǒng)與免疫的關(guān)系已經(jīng)成為應(yīng)激研究領(lǐng)域的一個熱點問題。由于交感神經(jīng)系統(tǒng)在情緒應(yīng)激免疫調(diào)節(jié)中的作用尚未得到證實,故本研究利用本實驗室已建立的兩種情緒應(yīng)激體液免疫抑制作用的動物模型,通過分析皮質(zhì)酮、腎上腺素、去甲腎上腺素水平與體液免疫功能間的相關(guān)性及采用β-腎上腺素能受體拮抗劑心得安,著重探討外周交感神經(jīng)系統(tǒng)在情緒應(yīng)激體液免疫調(diào)節(jié)中的作用。材料和方法一、動物中心模型雄性Wistar大鼠,體重250～300克,鼠齡3個月左右,購于中國科學(xué)院遺傳所動物中心。每只大鼠單籠喂養(yǎng),控制室溫(20±3)℃和照明(12小時照明/12小時黑暗,每天早7時開始照明)。適應(yīng)期內(nèi)所有動物自由飲食、水,飼料由北京市實驗動物中心提供。二、實驗程序1.眼底充放電實驗30只動物經(jīng)1周適應(yīng)期后,給予抗原免疫?？乖怯寐亚宓鞍?gradeVovalbumin,OVA;Sigma公司產(chǎn)品)溶于磷酸緩沖液(PBS)(pH=7.3),再用等量的福氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化而成,濃度為200μg/ml,每只大鼠腹腔注射100μg/0.5mlOVA。免疫后第二天開始給予應(yīng)激刺激。足底電擊給予的頻率和強度是1.0mA,持續(xù)時間3秒,間隔時間15秒,共33次,總時間為10分鐘。所有動物分成4組:電擊組(S),電擊+情緒應(yīng)激組(ES),裝置對照組1(A1)和裝置對照組2(A2)。S組動物免疫后2周內(nèi)無規(guī)律給予10分鐘/天,共6天的足電擊,其余時間內(nèi)無處置;ES組動物在給予S組動物電擊的當(dāng)天亦接受同樣強度和頻率的足電擊,而在2周內(nèi)的其余時間仍將其每天置于電擊裝置內(nèi)10分鐘而無電擊(恐懼的情緒應(yīng)激);A1組動物僅在給予S組動物電擊的當(dāng)天被置于電擊裝置中10分鐘而無電擊;A2組動物則每天被置于電擊裝置中10分鐘而無電擊。實驗在每天8:00～16:00間進(jìn)行且各組動物被交替置于電擊裝置中以排除激素分泌的晝夜節(jié)律變化對實驗的影響。二周后,ES和A2組動物被置于電擊裝置內(nèi)10分鐘后,而S和A1組動物在安靜狀態(tài)下,對所有動物進(jìn)行斷頭,取血和脾臟。2.次肌激性毒性給藥后情緒應(yīng)激,按照劑量和劑量確定60只動物被分成3組,情緒應(yīng)激組(ES)、生理應(yīng)激組(PS)和對照組(C)。經(jīng)一周適應(yīng)期后,進(jìn)行定時喂水訓(xùn)練10天。定時喂水訓(xùn)練為每日兩次僅每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10給予飲水,其余時間不給水。第18天對所有動物進(jìn)行免疫,抗原注射方法和劑量同前。從免疫當(dāng)天(day0)晚21:00～21:10開始給予情緒應(yīng)激刺激,具體方法為在定時喂水期間給予ES組動物空瓶刺激誘發(fā)其情緒應(yīng)激,刺激的給予是無規(guī)律的,一天一次(早或晚)或一天兩次;PS組動物在ES組接受空瓶刺激的同時亦無水喝,但無空瓶刺激以排除生理缺水的影響;C組動物則一直定時飲水。這樣連續(xù)給予兩周,于免疫后第14天對所有動物斷頭取血和脾臟。3.ps和ps動物單籠飼養(yǎng)方法對比30只動物被分成3組:情緒應(yīng)激+心得安組(ES+Pro),情緒應(yīng)激+生理鹽水組(ES+Sal),生理應(yīng)激組(PS)。其中心得安組和生理鹽水組動物在一個房間內(nèi)單籠喂養(yǎng),而PS組動物則在另一個房間內(nèi)單籠喂養(yǎng)。所有動物經(jīng)過適應(yīng)期、定時喂水訓(xùn)練、抗原免疫,方法如前所述。同樣在抗原免疫的當(dāng)天晚上9:00～9:10開始給予心得安組和生理鹽水組動物情緒應(yīng)激刺激,給予的時間、時程、方法如前所述。只是在每次情緒應(yīng)激前30分鐘給予心得安組動物腹腔注射心得安(Sigma公司),劑量為5mg/kg體重,溶于生理鹽水中1mg/ml。生理鹽水組動物則在情緒應(yīng)激前30分鐘被注射同樣劑量的生理鹽水。生理應(yīng)激組動物處置與以前完全相同。二周后對所有動物斷頭取血和脾臟,進(jìn)行體液免疫功能測定。三、血清及血漿兒茶酚胺pahs的測定血清抗OVAIgG抗體測定采用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),酶標(biāo)儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品(基本步驟如下:1.用濃度為1mg/ml的OVA包被96孔板,在4℃下過夜,用含0.05%Tween20的PBS洗板2次,雙蒸水洗1次;2.用含0.005μlTween20/ml的1%BSA即牛血清白蛋白在室溫下封閉1小時,洗板同上;3.將稀釋度為1:100的待測血清及BSA加入96孔板中,100μl/孔,室溫下放置1小時,洗板同上;4.用BIO-RAD公司生產(chǎn)的過氧化物酶標(biāo)記的羊抗-鼠IgG在室溫下包被1小時,50μl/孔,洗板同上;5.將底物加入96孔板中,100μl/孔,室溫下放置5分鐘,直到顏色充分顯現(xiàn);6.用2N硫酸終止反應(yīng),50μl/孔;7.在酶標(biāo)儀上讀吸光度OD值);血清皮質(zhì)酮測定采用免疫放射分析法,測試藥盒為美國DPC公司生產(chǎn)的125I標(biāo)記的大鼠皮質(zhì)酮專用藥盒COAT-A-COUNT,儀器為GC-911-(放射免疫計數(shù)器;血漿兒茶酚胺測定采用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatographyHPLC)分析法,儀器為日本島津10A系列高效液相色譜儀。脾臟指數(shù)為脾臟重量mg與體重g之比值。結(jié)果一、土壤蛋白和臟器指數(shù)在電擊裝置誘發(fā)的情緒應(yīng)激體液免疫抑制作用的動物模型中,情緒應(yīng)激顯著降低動物抗OVA抗體水平和脾臟指數(shù),顯著升高腎上腺素、去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮水平,進(jìn)一步的SPSS相關(guān)分析結(jié)果表明,動物的脾臟指數(shù)與腎上腺素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.38,P<0.05),詳見圖1。而皮質(zhì)酮含量則與體液免疫功能間無相關(guān)性(P>0.05)。二、臟器指數(shù)與去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮水平的關(guān)系在以空瓶刺激誘發(fā)的情緒應(yīng)激體液免疫抑制作用的動物模型中,情緒應(yīng)激顯著降低動物抗OVA抗體水平和脾臟指數(shù),顯著升高腎上腺素、去甲腎上腺素和皮質(zhì)酮水平,進(jìn)一步的SPSS相關(guān)分析結(jié)果表明,動物的抗體OD值與去甲腎上腺素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.564,P<0.01),詳見圖2。而皮質(zhì)酮含量與體液免疫功能間仍無相關(guān)性(P>0.05)。提示交感神經(jīng)可能參與了情緒應(yīng)激體液免疫調(diào)節(jié)作用。三、情緒應(yīng)激對免疫調(diào)節(jié)的影響由圖3和圖4所示,給予心得安后,情緒應(yīng)激組動物的脾臟指數(shù)和抗體OD值由原來較生理應(yīng)激組動物顯著降低變?yōu)闊o顯著性差異,說明心得安能逆轉(zhuǎn)由情緒應(yīng)激引起的體液免疫抑制作用,進(jìn)一步明確了交感神經(jīng)系統(tǒng)在情緒應(yīng)激體液免疫調(diào)節(jié)中的作用。情緒應(yīng)激與免疫調(diào)節(jié)我們實驗室以前的研究結(jié)果已經(jīng)證實,由電擊裝置和空瓶刺激誘發(fā)的兩種情緒應(yīng)激均能顯著降低大鼠原發(fā)性體液免疫功能(抗體OD值和脾臟指數(shù)),顯著升高腎上腺素、去甲腎上腺素、皮質(zhì)酮水平。在此研究基礎(chǔ)上,利用SPSS相關(guān)分析,本研究發(fā)現(xiàn)在由電擊裝置誘發(fā)的情緒應(yīng)激體液免疫抑制模型中,動物脾臟指數(shù)降低與腎上腺素含量升高呈顯著負(fù)相關(guān)。而由空瓶刺激誘發(fā)的情緒應(yīng)激體液免疫抑制實驗同樣證實了動物的抗OVA抗體水平降低與去甲腎上腺素水平升高呈顯著負(fù)相關(guān)。同時我們發(fā)現(xiàn)兩個模型中,皮質(zhì)酮含量與體液免疫功能間均無相關(guān)性。這些結(jié)果提示,交感神經(jīng)系統(tǒng)參與了情緒應(yīng)激的體液免疫調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步證實交感神經(jīng)系統(tǒng)的作用,利用空瓶刺激模型,我們給予情緒應(yīng)激組動物腹腔注射心得安。心得安是一種中樞和外周β-腎上腺素能受體拮抗劑,即它能阻斷腎上腺素類神經(jīng)遞質(zhì)與受體的結(jié)合,從而阻斷情緒應(yīng)激組的交感神經(jīng)活性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),情緒應(yīng)激+心得安組動物抗體水平與生理應(yīng)激組間比較變?yōu)闊o顯著差異,也就是心得安逆轉(zhuǎn)了情緒應(yīng)激的體液免疫抑制作用,進(jìn)一步表明了交感神經(jīng)系統(tǒng)在情緒應(yīng)激體液免疫調(diào)節(jié)中的作用。該實驗結(jié)果與其他研究者的發(fā)現(xiàn)相一致。例如Lysle等報道,β-腎上腺素能受體拮抗劑心得安能阻斷由條件反射性應(yīng)激誘發(fā)的脾有絲分裂原反應(yīng)的改變;CroisetG等的研究結(jié)果同樣證實了β-腎上腺素能受體阻斷劑timolol和脾的去神經(jīng)支配都能阻止溫和的情緒應(yīng)激對SRBC原發(fā)抗體應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用,Mills的文章亦闡述了兒茶酚胺及其受體參與了急性應(yīng)激所引起的細(xì)胞免疫功能改變。這些發(fā)現(xiàn)連同我們的實驗結(jié)果證實了交感神經(jīng)系統(tǒng)確實參與了情緒應(yīng)激的免疫調(diào)節(jié)作用。那么交感神經(jīng)系統(tǒng)是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的?目前研究認(rèn)為,應(yīng)激狀態(tài)下交感神經(jīng)系統(tǒng)主要通過以下幾種機制影響免疫系統(tǒng)功能:①去甲腎上腺素和腎上腺素與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合后,激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶,促進(jìn)三磷酸腺苷(ATP)轉(zhuǎn)化成環(huán)磷酸腺苷(cAMP),提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,而已有大量研究證實,淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高或cAMP/cGMP比率升高,能降低免疫反應(yīng)功能包括淋巴細(xì)胞有絲分裂原的反應(yīng)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的強度、B細(xì)胞激活和抗體形成、輔助T淋巴細(xì)胞功能及抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等,從而降低免疫功能。另外研究表明,兒茶酚胺對淋巴細(xì)胞