糖的核磁共振性質(zhì)

第五節(jié)糖的核磁共振性質(zhì)一、糖的1HNMR性質(zhì)1、糖的端基質(zhì)子信號在δ5.0ppm附近，δ4.3~6.0，1H（d）.多數(shù)呈現(xiàn)特征性的雙峰，少數(shù)呈現(xiàn)寬單峰。2、糖環(huán)質(zhì)子信號在δ3.5—δ4.5ppm之間。3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基質(zhì)子信號在δ1.0ppm附近.1端基質(zhì)子和甲基質(zhì)子的信號與其它信號相隔較遠(yuǎn)易于辨認(rèn)，可以推測糖的個數(shù)、糖的種類及連接位置24、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，廣泛應(yīng)用于吡喃糖環(huán)端基碳原子構(gòu)型的判斷?！恚航^大多數(shù)的D-吡喃糖(如葡萄糖),當(dāng)C1-OH處于橫鍵上(代表β-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=6-8Hz;當(dāng)C1-OH處于豎鍵上(代表α-苷鍵),C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=2-4Hz?！颍嘿|(zhì)子間的偶合常數(shù)與兩面角有關(guān)。

3※C2-H始終處于豎鍵上是判斷的前提?！事短桥c鼠李糖，雖然具有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，但其C2-H都處于橫鍵上，故無法判斷其苷鍵構(gòu)型。224偶合常數(shù)質(zhì)子的鄰位偶合常數(shù)(J)與兩面角(θ)有關(guān)對于吡喃糖，可以根據(jù)端基質(zhì)子的偶合常數(shù)確定苷鍵的構(gòu)型θ=90°，J很小θ=90~180°，θ↑，J↑θ=0~90°，θ↓，J↑

5在吡喃環(huán)中當(dāng)相鄰的兩個質(zhì)子均是豎鍵時，其兩面角為180°，偶合常數(shù)為6~8Hz在吡喃環(huán)中當(dāng)相鄰的兩個質(zhì)子一個豎鍵一個橫鍵時，其兩面角為60°，偶合常數(shù)為2~4Hz180°60°6

◆鼠李糖優(yōu)勢構(gòu)象是1C式12121122337α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C18在吡喃環(huán)中當(dāng)相鄰的兩個質(zhì)子均是豎鍵時，其兩面角為180°，偶合常數(shù)為6~8Hz；一個豎鍵一個橫鍵時，其兩面角為60°，偶合常數(shù)為2~4Hz。對于葡萄糖或半乳糖，β-D苷的J為6~8Hz；α-D苷的J為2~4Hz。甘露糖和鼠李糖相鄰兩個質(zhì)子的兩面角都約在60?左右，J值差別不大，不足以區(qū)分苷鍵的構(gòu)型。對于呋喃糖，無論其端基質(zhì)子和C2位質(zhì)子是處于順式還是反式，其J值均變化不大（都在0~5），故也不能判斷其苷鍵構(gòu)型。9通常，α-苷鍵端基質(zhì)子信號的化學(xué)位移>5.0ppm;β-苷鍵端基質(zhì)子信號的化學(xué)位移<5.0ppm.10二、糖的13CNMR性質(zhì)（一）化學(xué)位移與偶合常數(shù)1、D-吡喃糖的化學(xué)位移值

C1:α-型97～101ppmβ-型103～106ppmCH-OH(C2、C3、C4)70～78ppmCH2-OH(C6)62ppm左右

CH3（糖的甲基C）18ppm左右111）δ18ppm附近的信號來自于甲基五碳糖的C6，有幾個信號（扣除苷元中的甲基）可以表示有幾個甲基五碳糖存在；2）呋喃糖環(huán)上的碳信號較吡喃糖環(huán)上的碳信號出現(xiàn)在低場處，可以區(qū)別糖氧環(huán)的大小。3）端基碳的信號多數(shù)在95~105之間，有幾個信號可以認(rèn)為有幾種糖存在于糖鏈重復(fù)單位中；13C-NMR譜中，C原子信號規(guī)律：（表2-1）124）端基碳，帶有a-OH的較帶有e-OH的出現(xiàn)在較高場處，由此可以區(qū)別α-和β-異構(gòu)體（要注意糖的C1和1C式及糖的絕對構(gòu)型）；5）糖上大部分信號可和相似的糖或糖苷衍生物比較而指定。D型（C1）a-OH：α-e-OH：β-13※一般在13C-NMR譜中2、D-呋喃糖的化學(xué)位移值

CH2-OH(C1)64ppm左右

CH-OH（C3、C5）>80ppm（偏大）143、13C譜化學(xué)位移數(shù)據(jù)的應(yīng)用①依據(jù)97～106ppm區(qū)域13C信號的個數(shù)可判斷低聚糖及其苷中所含糖基的個數(shù).②如果端基13C信號出現(xiàn)在大于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為β-D或α-L；如果端基13C信號出現(xiàn)在小于100ppm的區(qū)域，則苷鍵構(gòu)型為α-D或β-L。因此，依據(jù)95~105ppm區(qū)域13C信號又可判斷低聚糖及其苷中所含苷鍵的構(gòu)型。

15③依據(jù)13C譜數(shù)據(jù)尚可判斷氧環(huán)的大小。

◆對于呋喃氧環(huán)

CH-OH（C3、C5）>80ppm◆對于吡喃氧環(huán)

CH-OH（C3、C5）<78ppm164、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)(1JC1-H1)可用于苷鍵構(gòu)型的確定.①

對于D-吡喃糖甲苷：

α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=166ppm;β-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=156ppm。

17②

對于L-鼠李糖甲苷：

α-苷鍵JC1-H1≈165~170Hzβ-苷鍵JC1-H1≈155~160Hz例如：α-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=168ppm;β-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=158ppm。5、呋喃型糖苷無法用端基碳與端基質(zhì)子的偶合常數(shù)來判斷其苷鍵構(gòu)型。18（二）苷化位移（glycosydationshift）1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元α-C、β-C的化學(xué)位移值均發(fā)生改變，這種苷化前后化學(xué)位移的變化現(xiàn)象，稱為苷化位移。端基碳苷元碳192、苷化位移一般規(guī)律①端基碳、苷元α-碳的化學(xué)位移值向低場方向移動5～6ppm（+5～+6）單位；②苷元β-碳的化學(xué)位移值向高場方向移動

3～4ppm（-3～-4）單位；③糖分子其他碳原子化學(xué)位移值變化不大。④苷元β-位有取代基時的苷化位移規(guī)律：20◆苷元α-碳和糖端基碳絕對構(gòu)型都為R（或S）時，苷化位移規(guī)律同①、②。端基碳α-碳β-碳21

◆苷元α-碳和糖端基碳絕對構(gòu)型不同時，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元β-位無取代基者大約高3.5ppm單位。端基碳α-碳22233、酯苷、酚苷的苷化位移規(guī)律：

苷化位移值較特殊，端基碳與羰基碳（即苷元α-碳）均向高場方向位移，β-C向低場方向位移。例如：齊墩果酸在成苷后，其分子結(jié)構(gòu)中既含醇苷、也有酯苷結(jié)構(gòu)?？捎糜趯Ρ扔嘘P(guān)碳原子化學(xué)位移值的變化情況。24端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-C25α-Cβ-Cβ-Cα-C264、苷化位移有關(guān)說明：①苷化位移值與苷元的結(jié)構(gòu)有關(guān)，與糖的種類無關(guān)。β-D-葡萄吡喃甲苷13C1=104.0ppmβ-D-甘露吡喃甲苷13C1=104.5ppm27②如果苷元為鏈狀結(jié)構(gòu)，則糖端基碳的苷化位移值隨著苷元為伯、仲、叔基而遞減。例如：與糖的甲苷化學(xué)位移比較，苷元分別為伯、仲、叔基時，糖端基碳的苷化位移值的變化情況如下，28端基碳化學(xué)位移值下降-2-4-729③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化學(xué)位移變化較大些，β-C稍受影響，其他碳原子受到的影響則較少。④在確定了苷中糖的種類以后，將苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用苷化位移規(guī)律可確定苷中糖的連接位置。30例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置◆將雙糖苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；◆如果內(nèi)側(cè)糖的某個碳原子的化學(xué)位移向低場方向移動了（通常是4~7ppm),而與其相鄰的兩個碳原子之化學(xué)位移值又略向高場方向移動（約1~2ppm),則內(nèi)側(cè)糖的這個碳原子就是糖的連接位置。31三、紅外光譜IR1.3700～3100cm-1間有明顯O-H吸收峰。2.如糖分子中含羧基、?；?，則相應(yīng)官能團(tuán)的IR吸收峰可見。3.多糖在1500～960cm-1有許多吸收峰，其中970～730cm-1間的峰可用作端基碳構(gòu)型判斷。例如：840cm-1吸收峰——α-L-吡喃糖苷

890cm-1吸收峰——β-D-吡喃糖苷32四、質(zhì)譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)性的衍生物才能進(jìn)行質(zhì)譜分析。2、糖的立體異構(gòu)體往往出現(xiàn)幾乎相同的質(zhì)譜，僅在碎片豐度上稍有區(qū)別（不能用質(zhì)譜來區(qū)別糖的構(gòu)型！）。3、糖和苷的分子量：可用CI(化學(xué)電離),FD-MS、FAB-MS等方法獲得分子離子峰后測出。334、軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能獲得從分子離子峰按順序失去一個個糖基后的碎片離子峰。如果事先測定了多糖的組成，則可根據(jù)質(zhì)譜的碎片離子峰信息來推斷原糖鏈的連接順序。34第六節(jié)糖鏈的結(jié)構(gòu)測定

※主要解決四個問題①單糖的組成；②糖的氧環(huán)大?。虎厶桥c糖之間的連接位置和順序；④苷鍵構(gòu)型。351、多糖是高分子化合物，其純度與小分子化合物的標(biāo)準(zhǔn)判斷不同。即使是一種多糖純品，其微觀也不均一。2、多糖純品實質(zhì)上是一定分子量范圍的均一組分。3、多糖純度常用的測定方法36（一）純度測定方法1、高壓電泳法

※原理：由于中性多糖導(dǎo)電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，常將其制成硼酸絡(luò)合物進(jìn)行高壓電泳。

※電泳支持體：玻璃纖維絲、純絲綢布等。

※緩沖液：pH=9-12的硼砂溶液。

※電壓：30-50V/cm37

※

時間：30-120min※

顯色劑：p-甲氧基苯胺-硫酸?！⒁猓罕仨毷褂美鋮s系統(tǒng)，將溫度維持在

0℃,以免燒壞支持體。※本法常用2、超離心法※原理：由于微粒在離心力場中移動的速度與微粒的密度、大小與形狀有關(guān)，故將多糖38溶液進(jìn)行密度梯度超離心時，如果是組成均一的多糖，則應(yīng)呈現(xiàn)單峰。※具體做法：將多糖樣品制成1%-5%的氯化鈉或tris-鹽溶液，接著進(jìn)行密度梯度超離心，待轉(zhuǎn)速達(dá)到恒定后（6000轉(zhuǎn)/min），采用間隔照明法檢測其是否為單峰。393、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度達(dá)到10%左右，離心得沉淀。上清液再用乙醇使其濃度達(dá)到20%-25%左右，離心得到第二次沉淀。比較兩次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同則為純品，否則為混合物。4、其他方法如凝膠柱色譜、官能團(tuán)摩爾比恒定法等。通常要確定一種多糖的均一性，至少要有兩種以上的方法40（二）分子量測定

多糖的分子量從幾萬到幾百萬不等，雖然多糖經(jīng)過提純，但是多糖實際上仍然是大小分子不同的混合物，故所測定的分子量是一種統(tǒng)計平均值。1、測定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和滲透壓法等。2、凝膠過濾法簡介：在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定的關(guān)系。采用一系列結(jié)構(gòu)相似的已知分子量的多糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測定樣品多糖的分子量?！粼摲ㄓ昧啃?、操作較簡便。413、單糖、低聚糖及其苷分子量的測定※最常用FD-MS、FAB-MS與電噴霧-MS4、多糖分子量的測定方法①基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（matrixasistedlaserdesorptionionization,MALDI-MS）②基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜

(matrixasistedlaserdesorptionionization/timeofflight,MALDI-TOF-MS).42（三）單糖的鑒定

概述：在中草藥成分分離工作中，或在苷和多糖的水解產(chǎn)物中，常常會得到一些單糖成分，須要加以證明。目前發(fā)現(xiàn)新單糖須要進(jìn)行結(jié)構(gòu)決定的機(jī)會較少，多數(shù)工作為進(jìn)行糖的印證。糖的水溶性很大，且不易獲得結(jié)晶，有些物理常數(shù)不易測定，給印證工作帶來困難，以往用化學(xué)方法制成衍生物，再作分離鑒定，手續(xù)繁復(fù)?，F(xiàn)多采用各種色譜技術(shù)，對糖類進(jìn)行鑒定。43（三）單糖的鑒定

1．紙層析①展開系統(tǒng)：常用水飽和的有機(jī)溶劑如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上層）BAW

正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展開方式：上行、下行等③顯色劑：可利用糖的還原性或形成糠醛后引起的一些呈色反應(yīng)。例如，44※鄰苯二甲酸苯胺※硝酸銀試劑（使還原糖顯棕黑色）※三苯四氮唑鹽試劑（單糖和還原性低聚糖呈紅色）※3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑（酮糖呈紅色）※過碘酸-聯(lián)苯胺（糖、苷和多元醇中有鄰二-OH結(jié)構(gòu)顯蘭底白斑）。452．薄層層析①采用（硼酸液/無機(jī)鹽）+硅膠→制板②吸附劑：硅膠（用0.03M硼酸液或無機(jī)鹽的水液代水制板）※常用的無機(jī)鹽—0.3M磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉、0.02M乙酸鈉、0.1M亞硫酸氫鈉/H2O等③顯色劑：除紙層析應(yīng)用以外，還有H2SO4/H2O或乙醇液、茴香醛-硫酸試劑、苯胺-二苯胺磷酸試劑等。463．氣相層析①將糖制備成三甲基硅醚②醛糖用NaBH4還原成多元醇，制成乙?；锘蛉阴；?。4．離子交換層析①原理：糖的硼酸絡(luò)合物可進(jìn)行離子交換層析47②優(yōu)點：不必制成衍生物，而直接用水溶液進(jìn)行分離（與氣相比較）③需要儀器—糖自動分析儀5．液相色譜①填充材料——化學(xué)修飾的硅膠②優(yōu)點：不必制備成衍生物。適合分析對熱不穩(wěn)定的、不揮發(fā)的低聚糖和多糖。③缺點：靈敏度不及氣相層析高。48◆多糖組成的鑒定

1、必要性：低聚糖、多糖的結(jié)構(gòu)分析，首先要了解由哪些單糖所組成、各種單糖之間的比例等。2、多糖組成鑒定過程：將苷鍵全水解，用PC檢出單糖的種類，經(jīng)顯色后用薄層掃描儀求得各種糖的分子比（也可用GC或HPLC對各單糖定性定量分析）。49（四）糖連接位置的測定1、化學(xué)方法：多采用甲基化法①過程：將糖鏈全甲基化，然后水解所有的苷鍵，用氣相色譜法對水解產(chǎn)物—甲基化單糖—進(jìn)行定性和定量分析。②甲基化過程：常用箱守法(Hakomori)③水解過程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/LH2SO4或三氟乙酸水解。如此可保證水解條件盡可能溫和，否則會發(fā)生去甲基化反應(yīng)和降解反應(yīng)，導(dǎo)致得出錯誤的結(jié)論。

50④氣相色譜法定性和定量分析：選擇各種單糖的標(biāo)準(zhǔn)品，分別與水解后得到的各種甲基化單糖進(jìn)行比較，具有游離-OH的部位就是糖的連接位置，而全甲基化的單糖即為末端糖。⑤計算過程：算出所得各甲基化產(chǎn)物相互之間的比例，據(jù)此可推測出糖鏈重復(fù)單位中各種單糖的數(shù)目。51①全甲基化②水解游離羥基游離羥基522、NMR譜法（了解內(nèi)容）

①13CNMR譜法：目前用來確定糖的連接位置的常用方法※該法是在歸屬各碳信號的基礎(chǔ)上，以游離苷元和甲基糖苷作為參考化合物，確定產(chǎn)生苷化位移的碳，然后利用苷化位移規(guī)則，即可方便地獲知各單糖的連接位置。53②1HNMR譜法：

※先使糖與苷乙?；?，再比較不同類型質(zhì)子的化學(xué)位移。

例如：CHOAc中CH質(zhì)子的化學(xué)位移為4.75~5.4ppm;而CH2OAc、CH2OR中質(zhì)子在3.0~4.3ppm；端基質(zhì)子介于這兩者之間。

※通過2D-NMR判定質(zhì)子的歸屬，從而得出糖的連接位點。54③在被苷化的糖分子結(jié)構(gòu)中，通常與端基碳直接相連的α-C的化學(xué)位移變化較大些，β-C稍受影響，其他碳原子受到的影響則較少。④在確定了苷中糖的種類以后，將苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，利用苷化位移規(guī)律可確定苷中糖的連接位置。55例如：判斷雙糖苷中兩單糖的連接位置◆將雙糖苷的13C譜數(shù)據(jù)與相應(yīng)單糖的13C譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較；◆如果內(nèi)側(cè)糖的某個碳原子的化學(xué)位移向低場方向移動了（通常是4~7ppm),而與其相鄰的兩個碳原子之化學(xué)位移值又略向高場方向移動（約1~2ppm),則內(nèi)側(cè)糖的這個碳原子就是糖的連接位置。56（四）糖連接位置的測定1、化學(xué)方法：多采用甲基化法首先將糖鏈全甲基化，然后水解所有的苷鍵，用氣相色譜法對水解產(chǎn)物—甲基化單糖—進(jìn)行定性和定量分析。①定性分析：需要選擇各種單糖的標(biāo)準(zhǔn)品②計算各甲基化產(chǎn)物相互之間的比例，推測糖鏈重復(fù)單位中各種單糖的數(shù)目57①全甲基化②水解582、NMR譜法①13CNMR譜法：是目前用來確定糖的連接位置的常用方法※該法是在歸屬各碳信號的基礎(chǔ)上，以游離苷元和甲基糖苷作為參考化合物，確定產(chǎn)生苷化位移的碳，然后利用苷化位移規(guī)則，即可方便地獲知各單糖的連接位置。59

②1HNMR譜法：首先是使糖與苷先乙?；又容^不同類型質(zhì)子的化學(xué)位移值。例如：CHOAc中CH質(zhì)子的化學(xué)位移為

4.75~5.4ppm;而CH2OAc、CH2OR中質(zhì)子的化學(xué)位移在3.0~4.3ppm；端基質(zhì)子的化學(xué)位移介于這兩者之間。最后通過2D-NMR就可判定質(zhì)子的歸屬，從而得出糖的連接位點。60（五）糖鏈連接順序的決定1、經(jīng)典方法：部分水解法

※過程：多糖→部分水解→低聚糖→分析低聚糖連接順序→推測糖鏈連接順序2、馳豫時間法

※基本原理：外側(cè)糖的自旋晶格馳豫時間T1比內(nèi)側(cè)大，同一糖上各碳的自旋晶格馳豫時間T1則基本相同。613、質(zhì)譜分析法※先了解糖的組成，再根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律和化合物的裂解碎片推測低聚糖及其苷中糖鏈的連接順序。※可解決低聚糖及其苷中糖鏈的連接順序，但難于準(zhǔn)確確定糖鏈的連接位置?！蟮途厶羌捌滠罩械奶遣荒苁峭活愄?。否則因同一類糖所丟失的質(zhì)量相等而無法推斷糖鏈的連接順序。62近年來不依賴樣品揮發(fā)的質(zhì)譜技術(shù)如場解析質(zhì)譜（FD-MS）和快原子轟擊質(zhì)譜（FAB-MS）在苷的結(jié)構(gòu)測定中得到廣泛的應(yīng)用。FD-MS和FAB-MS均可給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+、[M+K]+、[M+Na]+、[M-H]-和一系列失去糖的碎片峰[M-162+H]+（162表示失去糖的質(zhì)量為162+H2O=180）、[M-162-146+H]+、[M-H-146]-等等。FD-MS給出高質(zhì)量區(qū)信息較豐富，但苷元部分的結(jié)構(gòu)碎片信息較少，F(xiàn)AB-MS則在低質(zhì)量區(qū)還給出苷元的結(jié)構(gòu)碎片，因而應(yīng)用越來越普遍634、現(xiàn)代方法：NMR與2D-NMR法

在歸屬各個碳原子與H原子信號的基礎(chǔ)上，利用HMBC（異核多鍵相關(guān)）、NOESY（二維NOE譜）等波譜技術(shù)，通過觀察相連碳?xì)浠騂H遠(yuǎn)程偶合，推斷糖鏈的連接順序與連接位置。64糖連接位置確定還可采用NOE實驗，選擇性照射糖的端基質(zhì)子可觀察到與糖連接位置的碳上質(zhì)子的增益。HMBC也被廣泛用于苷中糖的連接位置的確定，在HMBC譜中糖的端基氫與連接位置的碳有明顯的相關(guān)點。全相關(guān)譜TOCSY對于糖環(huán)的連續(xù)相互偶合氫的歸屬特別有用，當(dāng)糖的數(shù)目較多時，糖上氫信號嚴(yán)重重疊，往往可以通過任何一個分離較好的信號，得到所有該信號偶合體系中的其他質(zhì)子信號，進(jìn)行歸屬65HMBC譜，即1H檢測的異核多鍵相關(guān)實驗，該項技術(shù)采用較小的2JCH或3JCH偶合，解決了分子中隔碳相連的問題，可以觀測到質(zhì)子與相隔而2-3個或更多個化學(xué)鍵的碳原子；因此它可以連接結(jié)構(gòu)單元；組裝結(jié)構(gòu)片斷，從而確定化合物的分子骨架。在皂苷中可以確定糖的連接順序和位置66（六）苷鍵構(gòu)型及氧環(huán)的確定1、苷鍵構(gòu)型測定方法如下：⑴.分子旋光差法（klyne法）

分子旋光=（旋光度×分子量）/100

苷和苷元的分子旋光差與組成該苷的糖的一對甲苷的分子旋光度進(jìn)行比較，數(shù)值上相接近的便是與之有相同苷鍵的一個67有一苷[M]G=-273.03（G代表苷），知是豆甾醇的葡萄糖苷，苷元豆甾醇[M]A=-210.04（A代表苷元），求苷的構(gòu)型？(已知：葡萄糖甲苷α=+308.6β=-66.4)例：68⑵.酶催化水解方法例如：麥芽糖酶只能水解α-苷鍵；苦杏仁酶只能水解β-苷鍵等。69⑶1H-NMR判斷糖苷鍵的相對構(gòu)型通過C1-H與C2-H的偶合常數(shù)來判斷苷鍵的構(gòu)型.

例如：D-吡喃糖，

α-苷鍵：JH1-H2=2-4Hzβ-苷鍵：JH1-H2=6-8Hz70⑷13C-NMR判斷糖苷鍵的構(gòu)型通過C1-H1偶合常數(shù)來判斷苷鍵的構(gòu)型.

例如：D-葡萄吡喃甲苷，

α-苷鍵：JC1-H1=170Hzβ-苷鍵：JC1-H1=160Hz713、糖氧環(huán)大小的測定①根據(jù)13CNMR數(shù)據(jù)來判斷例如：吡喃糖環(huán)中13C3-NMR信號在72-78ppm;

呋喃糖環(huán)中13C3-NMR信號在80ppm以上。②分析Smith降解產(chǎn)物也可判斷氧環(huán)的大小。③利用甲醇解反應(yīng)來判斷呋喃型糖甲苷與吡喃型糖甲苷色譜行為不同。72二、糖鏈結(jié)構(gòu)研究實例

——皂角苷A的結(jié)構(gòu)測定1、皂角苷A為無定形粉末，是九糖三萜皂苷。2、HR-FAB-MS負(fù)離子源測得分子量為：1831.7649[M-H]-3、結(jié)合13CNMR、DEPT譜確定皂角苷A

分子式為：C82H128O45734、有關(guān)1HNMR數(shù)據(jù)：δ4.89(1H,d,J=7.3Hz),δ4.99(2H,d,J=7.6Hz),δ5.13(2H,d,J=7.1Hz),δ5.32(1H,d,J=7.7Hz),δ5.55(1H,d,J=7.3Hz),δ5.93(1H,d,J=8.2Hz),δ6.29(1H,s).745、有關(guān)13CNMR數(shù)據(jù)：δ94.4,δ100.9,δ103.8,δ104.2,δ104.9,δ105.5,δ105.8,δ106.2,δ106.9.※在δ100ppm處有9個吸收峰，說明皂角苷A分子結(jié)構(gòu)中含9個單糖。75

6、堿水解結(jié)果：獲得一個三糖苷（次級苷）

※

說明皂角苷A分子結(jié)構(gòu)中通過酯苷鍵連有一個六糖結(jié)構(gòu)。

7、酸水解后，再經(jīng)過氣相色譜分析，結(jié)果如下：①

皂角苷A中所含單糖為夫糖、半乳糖、木糖、雞納糖與鼠李糖；②

各單糖相互間的分子比為1：1：4：1：1768、薄層酸水解后，與標(biāo)準(zhǔn)品對照證明皂角苷A中尚含有另一個單糖——葡萄糖醛酸。9、將酸水解后所得苷元再經(jīng)過各種波譜數(shù)據(jù)對照證明，確認(rèn)該苷元為皂樹皂苷元。10、ESI-MS譜圖數(shù)據(jù)①m/z1699(M--H-132)提示：木糖(M=150，150-16-2=132)為末端糖；77②

m/z=955峰提示：脫掉了是一個六碳糖，在C3或C16位上連接的是一個由葡萄糖醛酸、半乳糖及木糖組成的三糖。11、對所有13CNMR、1HNMR信號進(jìn)行歸屬

（很復(fù)雜?。贇w屬的依據(jù)：1HNMR、13CNMR及其

1H-1HCOSY,1H-13CCOSY、NOESY等。78②從表2-4可看到：A、有兩個木糖E、F的端基質(zhì)子化學(xué)位移值完全一樣，表示這兩個氫信號重疊在一起。B、有一個木糖H與雞納糖的端基質(zhì)子化學(xué)位移值完全一樣，表示這兩個氫信號也重疊在一起。7912、通過HMBC（異核多鍵相關(guān)）譜確定糖與糖的連接關(guān)系13、根據(jù)1JC1-H1、C1-H與C2-H偶合常數(shù)以及C1的化學(xué)位移值確定苷鍵的構(gòu)型。8081第七節(jié)糖及苷的提取分離一、提取1、破壞或抑制酶的活性①植物體內(nèi)存在著多糖和苷，也存在著能水解該多糖和苷的酶（酶與多糖和苷共生！），但兩者存在于不同的植物組織中。為了獲得原存在于植物體中的原生苷，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄆ茐幕蛞种泼傅幕钚?。②破壞或抑制酶活性的常用方?/p>

A、以曬干或晾干的方法迅速干燥植物藥材；

B、提取時用沸水、甲醇、60%以上的乙醇等溶劑；

C、在中藥材中加入一定量的碳酸鈣拌勻后再用沸水提取。822、單糖、低聚糖及其苷類化合物的提取過程以水或稀醇為提取溶劑；回收提取溶劑得到中藥材的提取物；石油醚萃取提取物，得到油脂類物質(zhì)（極性小的化合物）；氯仿或乙醚萃取提取物，得到苷元；乙酸乙酯萃取提取物，得到單糖苷；正丁醇萃取提取物，得到低聚糖苷；833、多糖及其苷類化合物的提取過程①用甲醇或1：1乙醇/乙醚混合液將植物藥材脫脂（包括脫色素）；②水加熱提取2-3次，每次4-6小時（得水提部分-多糖、黏液質(zhì)、樹膠、木聚糖、糖原等溶解于熱水）

※多糖隨著聚合度的增加，性質(zhì)與單糖相差越來越大，一般是非晶形，無甜味，難溶于冷水，溶于熱水成膠體溶液。84③0.5mol/LnaOH水溶液提取2次（得堿溶部分-酸性多糖、半纖維素可溶解于稀堿）

※堿性多糖如氨基糖可溶于稀酸，纖維素在各種溶劑中均不溶解。為防止糖在酸性溶液中出現(xiàn)降解現(xiàn)象，以稀酸提取的時間宜短，且溫度應(yīng)該在5℃以下。④提取液分別濃縮；⑤用等量或數(shù)倍量甲醇或乙醇、丙酮等沉淀，獲得粗多糖；⑥對粗多糖反復(fù)溶解與醇析854、粗多糖及其苷類化合物的除蛋白質(zhì)過程采用醇沉方式所獲