促排卵因子在動(dòng)物輸卵管中的作用

促排卵因子在動(dòng)物輸卵管中的作用

動(dòng)物和動(dòng)物的卵由一些復(fù)雜的神經(jīng)分泌機(jī)制決定，包括繁殖器官和大腦之間的信號(hào)通道。在自發(fā)性排卵的動(dòng)物中(人、羊、牛和鼠等),一個(gè)成熟卵巢卵泡所分泌的雌激素觸發(fā)了下丘腦GnRH的釋放;而在誘導(dǎo)性排卵的動(dòng)物中(兔、貓和駱駝等),性交相關(guān)因子負(fù)責(zé)觸發(fā)GnRH的釋放。Adamsetal研究發(fā)現(xiàn):精漿中含有促進(jìn)排卵的因子。精漿中促排卵因子(OIF)的發(fā)現(xiàn)改變了長(zhǎng)久以來(lái)形成的關(guān)于控制排卵級(jí)聯(lián)的觀點(diǎn)。哺乳動(dòng)物精液中OIF所起的未知生物學(xué)功能可能在將來(lái)雄性和雌性不孕癥的診斷中起到重要的作用,在治療不孕癥新藥的開(kāi)發(fā)中也擁有很強(qiáng)的發(fā)展?jié)摿Α１疚膶囊韵?個(gè)方面對(duì)精液中的OIF進(jìn)行闡述:OIF的發(fā)現(xiàn)、OIF的作用及其通路、OIF的生化分離和提純、與劑量相關(guān)的OIF反應(yīng)及其作用機(jī)理、不同畜種間OIF的存在。1非人體交配條件對(duì)睪丸的影響第一次直接證明精液中存在一種OIF的發(fā)現(xiàn)是來(lái)自于中國(guó)的科學(xué)研究,他們認(rèn)為在雙駝駱駝中,精液中的一些因子負(fù)責(zé)激發(fā)排卵而不是來(lái)自于交配的機(jī)械刺激。當(dāng)給雌性雙駝駱駝的陰道內(nèi)或者肌內(nèi)/宮內(nèi)注射雙駝精漿后排卵發(fā)生。在早期1970年Fernandez-Bacaetal對(duì)羊駝、駝馬和新世界血緣相關(guān)駱駝的研究發(fā)現(xiàn),自然體內(nèi)交配后95%以上的雌性發(fā)生排卵,相反沒(méi)有體內(nèi)交配則只有14%以下的雌性發(fā)生排卵。由此早期的學(xué)者認(rèn)為:在羊駝和駝馬中,交配過(guò)程中生殖器的物理刺激是促排卵的主要觸發(fā)因素。但是,早期的研究并沒(méi)有去設(shè)計(jì)控制潛在的可能影響排卵的混雜因素(如人工授精過(guò)程中也有對(duì)生殖器的物理刺激)。與此前研究明顯相反的是,1994年Sumar的研究則發(fā)現(xiàn)只有6/10的羊駝和5/8的駝馬在人工授精(陰道內(nèi)注射羊駝精液)后發(fā)生排卵。此后的研究則更加注意去設(shè)計(jì)控制其它的潛在因素,并已經(jīng)采用肌內(nèi)注射精漿來(lái)規(guī)避對(duì)陰道、子宮頸和子宮的物理刺激。OIF在雙駝駱駝上的原始發(fā)現(xiàn)在將近20年間未被廣泛關(guān)注,一直到2005年間Adamseta在羊駝和駝馬上一系列的研究才明確了精漿對(duì)排卵的作用。對(duì)羊駝和駝馬進(jìn)行單獨(dú)的精漿肌注(1/4排出),促發(fā)了90%以上的雌性發(fā)生排卵。精漿中OIF的作用主要發(fā)現(xiàn)于誘發(fā)性排卵動(dòng)物中,因?yàn)闆](méi)有自發(fā)性排卵的混雜影響可以更清楚地研究影響排卵發(fā)生的因素。但是,研究表明:精漿中的OIF同時(shí)出現(xiàn)在誘導(dǎo)性和自發(fā)性排卵的動(dòng)物中。2精漿與gnrh的關(guān)系一系列羊駝和駝馬的肌內(nèi)注射和宮內(nèi)注射精漿試驗(yàn)檢驗(yàn)了精漿對(duì)同種母畜促排卵的影響及其作用通路。在以上試驗(yàn)中,當(dāng)1個(gè)≥8mm的生長(zhǎng)卵泡被觀測(cè)到時(shí)(即排卵可能存在時(shí))才進(jìn)行注射試驗(yàn)。4次以上的重復(fù)試驗(yàn)觀察到的結(jié)果是:肌內(nèi)注射精漿組的排卵率達(dá)到94%(33/35),而生理鹽水注射組排卵率為0%;宮內(nèi)注射精漿組的排卵率為39%(17/44),而生理鹽水組排卵率為0%。精漿注射后的29.3±0.7h內(nèi)每個(gè)4小時(shí)進(jìn)行一次排卵的超聲檢測(cè)(自然交配、GnRH處理和LH處理后排卵的間隔期分別為30.0±0.5h、29.3±0.6h和29.3±0.7h)。但是,12只母羊駝在子宮頸注射精漿后并沒(méi)有觀察到排卵。之后的研究如Rattoetal、Silvaetal、Tancoetal認(rèn)為,這有可能是生殖器粘膜層減弱了OIF的吸收。與之相對(duì)應(yīng)的是,羊駝和駝馬的交配是一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程(30~50min),而精液是子宮內(nèi)被排出。經(jīng)子宮內(nèi)膜刮除后的羊駝再進(jìn)行子宮內(nèi)精漿注射提高了排卵反應(yīng),由此認(rèn)為OIF是通過(guò)一個(gè)系統(tǒng)而并不是由一個(gè)局部通路發(fā)揮作用的。精漿經(jīng)肌內(nèi)注射、子宮內(nèi)膜刮除后宮內(nèi)注射和非刮除術(shù)宮內(nèi)注射所引起的排卵率分別為93%、67%和24%。根據(jù)以上結(jié)果,實(shí)驗(yàn)人員認(rèn)為:在自然狀態(tài)下的自然交配過(guò)程中,母畜對(duì)精漿中OIF的吸收是通過(guò)表皮脫落的子宮內(nèi)膜充血協(xié)助完成的。為了進(jìn)一步測(cè)定精漿處理后的促排卵是否經(jīng)排卵前的LH峰一起發(fā)揮作用,駝馬的血樣在精漿處理后8小時(shí)被采集并分析。精漿處理后駝馬和雙駝駱駝的LH峰到來(lái)的時(shí)間和自然交配是相近的(處理后0.5h之內(nèi),最久不超過(guò)2h),而且LH峰延續(xù)的時(shí)間比GnRH處理后的要長(zhǎng),LH濃度在處理后8h還未回歸到正常濃度。精漿對(duì)引起黃體的作用并沒(méi)有促排卵的作用明顯。與GnRH促排卵相比,精漿促排卵形成的黃體更大,退化更晚,并且形成2倍多的孕酮。由于LH峰和黃體形成及作用存在正相關(guān),因此精漿與GnRH處理的對(duì)比試驗(yàn)說(shuō)明精漿中OIF的促黃作用是由LH所介導(dǎo)的。通過(guò)使用駝馬分離和純化的OIF的進(jìn)一步試驗(yàn)也已經(jīng)表明精漿具有促LH釋放和促黃作用。3ratchetal試驗(yàn)此前已經(jīng)嘗試?yán)藐庪x子交換法和疏水層析法去分離和提純駱駝精漿中的OIF[10~12],但是這些方法缺少一種生物驗(yàn)證方法去數(shù)量化的檢測(cè)細(xì)胞碎片的影響,因此還不能確定分離純化得到是OIF。其中Panetal研究認(rèn)為,OIF是一個(gè)巨大的褶皺復(fù)合體,其由糖蛋白表層和介于16-54Kd的不同分子所構(gòu)成生物活性構(gòu)造物所組成。另外一個(gè)學(xué)者XilongandZhaoetal則根據(jù)體外培養(yǎng)大鼠腦下垂體細(xì)胞的試驗(yàn)認(rèn)為駱駝精漿中起碼有2種碎片成分能夠增加LH的分泌。根據(jù)人類精漿的LH釋放對(duì)腦下垂體細(xì)胞作用和GnRH所呈現(xiàn)出的免疫反應(yīng),最初認(rèn)為的OIF和GnRH肽相關(guān)的說(shuō)法是有一定道理的。但是,在接下去所做的GnRH抗體作用于體外培養(yǎng)大鼠腦下垂體細(xì)胞的試驗(yàn)中,GnRH抗體并不能消除羊駝精漿對(duì)LH釋放的作用,因此OIF與GnRH具有一種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。為了去除精漿中的生物活性,Rattoetal設(shè)計(jì)了3個(gè)相關(guān)處理試驗(yàn):(1)分子團(tuán)的去除過(guò)濾;(2)經(jīng)過(guò)蛋白酶K、炭化和加熱處理;(3)經(jīng)過(guò)蛋白酶E處理。駝馬體內(nèi)排卵試驗(yàn)被用于檢測(cè)經(jīng)過(guò)以上處理的精漿中剩余的多種碎片成分,結(jié)果表明OIF不是類固醇和前列腺素,也不是GnRH,而是一種蛋白分子,它有抗熱性和抗蛋白酶K消化性,并且是大于30kD的一種分子團(tuán)。在接下來(lái)的Rattoetal試驗(yàn)中,駝馬精漿中的蛋白碎片利用液相層析法被分離和純化,并利用駝馬體內(nèi)排卵試驗(yàn)對(duì)其促排卵生物活性進(jìn)行檢測(cè)。3種蛋白碎片(碎片A、B和C)利用氫氧磷灰石柱層析法被清楚的鑒別出來(lái)。一種明顯的與14kDa團(tuán)相聯(lián)接的蛋白,利用SDSPAGE被鑒別為碎片C,碎片C被載入到丙烯葡聚糖凝膠過(guò)濾柱,然后利用快速蛋白液相層析法進(jìn)行進(jìn)一步的純化,結(jié)果得到另外2種小碎片(C1和C2),它們?cè)诤笃谠絹?lái)越顯著。在對(duì)駝馬進(jìn)行肌內(nèi)注射碎片C2后,它能夠引起排卵前的LH峰,這之后排卵發(fā)生和黃體生成。有趣的是,在經(jīng)過(guò)接下來(lái)的蛋白分子團(tuán)分離之后Rattoetal發(fā)現(xiàn),駝馬精漿中只有一半左右大于30kDa的碎片(利用離心過(guò)濾裝置去除額定的分子團(tuán))才能提升排卵。但是,蛋白酶K的部分酶解消化并不能消除生物活性,雖然蛋白酶K能酶解所有≤19kDa的蛋白質(zhì)。這種發(fā)現(xiàn)被解釋為是,14kDa蛋白是一種巨大蛋白復(fù)合體的一部分,或者是一種具有生物活性的激素原結(jié)構(gòu)。4oif直接作用于腦下垂體的細(xì)胞從駝馬精漿中純化得到的OIF用于檢測(cè)OIF劑量的多少是否會(huì)影響促排作用,母駝馬被單獨(dú)肌注劑量為500μL、250μL、125μL和60μL的純化OIF,被觀測(cè)到具有劑量相關(guān)變化的是:LH濃度、排卵率、最大CL直徑、CL直徑變化和血漿中的孕酮濃度。由此認(rèn)為,不同劑量的精漿OIF對(duì)排卵和黃體形成及功能都具有不同的影響,并且OIF的這種生物學(xué)作用是可以被生理學(xué)相關(guān)劑量所驗(yàn)證的。哺乳動(dòng)物排卵的發(fā)生是伴隨著下丘腦中央基底細(xì)胞核分泌GnRH到垂體的門靜脈系統(tǒng),接著是腦下垂體釋放LH到循環(huán)系統(tǒng)。LH濃度的升高引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng):卵泡壁的破裂和液體及細(xì)胞內(nèi)容物的排放。同時(shí),我們知道精漿OIF的排卵作用是通過(guò)一股釋放到循環(huán)中的LH所介導(dǎo)的,但是不清楚的是其作用點(diǎn)是在下丘腦還是在腦垂體水平,或者兩者都是。2012年Bogleetal最新研究表明,OIF是直接在腦下垂體水平來(lái)提升LH分泌的。取羊駝的腦下垂體前葉細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),經(jīng)處理培養(yǎng)后測(cè)定其LH濃度。結(jié)果顯示,經(jīng)OIF和GnRH處理能比未處理促進(jìn)分泌更多的LH,而且高劑量處理要比低劑量處理分泌更多的LH,試驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)OIF劑量反應(yīng)是相對(duì)應(yīng)的。雖然以上結(jié)論不能確定作用發(fā)生在下丘腦水平,他們認(rèn)為OIF直接作用于腦下垂體促性腺激素細(xì)胞而非下丘腦介入。為了測(cè)定活體OIF的作用點(diǎn),駝羊被預(yù)先注射GnRH抗拮劑,以消除其對(duì)OIF作用的影響,并認(rèn)為OIF對(duì)下丘腦GnRH神經(jīng)的作用是直接或者間接的。5其它精漿在致病性向大、排卵動(dòng)物中的作用文章之前已經(jīng)提到,近期的研究結(jié)果認(rèn)為精漿中的OIF同時(shí)存在于誘發(fā)性排卵和自發(fā)性排卵物種中。誘發(fā)性排卵和自發(fā)性排卵是根據(jù)促發(fā)下丘腦釋放GnRH的不同方式來(lái)進(jìn)行劃分的。在自發(fā)性排卵動(dòng)物中(人、羊、牛、馬和豬等)隨著孕酮的出現(xiàn),雌激素水平達(dá)到一定程度引發(fā)了下丘腦釋放GnRH。同時(shí)出現(xiàn)規(guī)律的黃體化發(fā)生和一個(gè)或者更多能產(chǎn)生雌激素卵泡的發(fā)育,并且在正常發(fā)情周期會(huì)出現(xiàn)排卵前的一股LH峰。在誘發(fā)性排卵動(dòng)物中(兔、貂、貓和駱駝等),下丘腦GnRH的分泌是來(lái)自于交配而來(lái)的神經(jīng)信號(hào)觸發(fā)的,然后引起排卵前腦下垂體的LH釋放。與自發(fā)性排卵相似的是,誘發(fā)性排卵動(dòng)物也需要一股LH峰來(lái)完成排卵過(guò)程,但是這必須是在交配刺激之下,因此不具備一定的排卵周期。早前研究發(fā)現(xiàn),雖然排卵數(shù)量比較少,但是牛精漿具有使雙駝駱駝和羊駝促排卵的功能。為了確定同種和異種精漿對(duì)促排卵的影響,試驗(yàn)研究了駝馬、羊駝和牛精漿對(duì)母駝馬促排卵的影響。結(jié)果顯示這3種精漿都能促發(fā)排卵,由此認(rèn)為OIF是哺乳動(dòng)物精漿中的固有組分,即異種間也能對(duì)卵巢發(fā)揮作用。目前OIF也被發(fā)現(xiàn)于馬和豬的精漿中,只是馬和豬的精漿促發(fā)駝馬較低的排卵率,這有可能是在馬和豬的精漿OIF濃度比較低,或者種間存在一個(gè)不同的亞型。但是同樣方法對(duì)母兔進(jìn)行處理后經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn),腔前卵泡和黃體化未破裂卵泡的數(shù)量明顯增加了。同時(shí)Bogleetal為了確定OIF在自發(fā)性排卵動(dòng)物中的作用,對(duì)誘發(fā)性排卵動(dòng)物(駝馬和駱駝等)精漿作用于自發(fā)性排卵動(dòng)物(牛、馬和豬等)的影響也進(jìn)行了相對(duì)應(yīng)研究。試驗(yàn)采用駝馬的精漿作用于母鼠,結(jié)果顯示駝馬精漿不僅促發(fā)更多老鼠排卵,而且還能提高每只老鼠的排卵數(shù)(功能接近于hCG)。但是Tancoetal的試驗(yàn)結(jié)果顯示,純化后的駝馬精漿OIF卻不能促發(fā)母牛排卵。但是OIF加速了現(xiàn)存優(yōu)勢(shì)卵泡的消退和新一波卵泡波的到來(lái),由此認(rèn)為OIF對(duì)自發(fā)性排卵的作用是通過(guò)抑制優(yōu)勢(shì)卵泡來(lái)控制