流感病毒實驗室PCR檢測技術(shù)

流感病毒實驗室PCR檢測技術(shù)1精選課件標(biāo)本采集應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)的流感檢測方案應(yīng)采集鼻拭子和/或咽拭子，和/或依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作來進行采集。對標(biāo)本采集者應(yīng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o。對于標(biāo)本的處理、儲存和運輸應(yīng)遵照流感病毒AH5N1的操作指南來進行。2精選課件標(biāo)本采集（一）主要采集上呼吸道標(biāo)本鼻咽拭子：將棉簽平行于上顎插入鼻孔，保持幾秒吸收分泌物。口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃體部位，避免觸及舌部；迅速將棉簽放入無菌、內(nèi)裝3-5ml樣本運送液及帶墊圈的螺口塑料管中，在靠近頂端處折斷，旋緊管蓋并密封。氣管分泌液：收集氣管吸取液或支氣管灌溉液5-10ml放入無菌、帶墊圈的50ml螺口塑料管中，立即密封。3精選課件標(biāo)本采集（二）血清：采集5-10ml全血放入帶墊圈的螺口管中，不加抗凝劑，待血液凝固分離血清，-20℃保存，血凝塊滅菌處理后棄掉；采集時間：入院后24小時；14-28天或出院當(dāng)日。4精選課件采樣液的要求標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４娌蓸右簯?yīng)包含有一定量的蛋白質(zhì)和抗菌素最佳采樣液：Hank’s液，Eagel’s液,生理鹽水BD15ML采樣管拭子是聚脂纖維桿可折斷，不推薦棉拭和木桿5精選課件臨床樣本收集的注意事項操作要細心，嚴防標(biāo)本間交叉污染，要做好自我保護采集標(biāo)本要有一定力度標(biāo)本采集后應(yīng)迅速至于冰上或者4℃以下保存，因為流感病毒對熱很敏感標(biāo)本管上寫明：醫(yī)院名稱，標(biāo)本號，患者姓名，性別，采樣日期標(biāo)本采集后4℃保存，盡量在24小時內(nèi)送到實驗室進行檢測，未能及時進行檢測的應(yīng)放-70℃或以下保存，放置4℃不應(yīng)超過4天6精選課件臨床標(biāo)本運輸

臨床標(biāo)本應(yīng)按照A類包裝要求運送，并用干冰運輸。所有標(biāo)本應(yīng)標(biāo)示清楚。疑似病例標(biāo)本運送應(yīng)包含的信息請參照禽流感標(biāo)本運輸。7精選課件A類感染性物質(zhì)指在運輸過程中與之接觸能對健康人或動物造成永久性殘疾或致命疾病的感染性物質(zhì)。此處“接觸”系指感染性物質(zhì)離開保護性包裝與人或動物的身體接觸或經(jīng)呼吸道吸入的情況。A類感染性物質(zhì)使人染病或使人和動物都染病者聯(lián)合國編號為UN2814，其運輸專用名稱為危害人的感染性物質(zhì)；僅使動物染病者聯(lián)合國編號為UN2900，其運輸專用名稱為僅危害動物的感染性物質(zhì)。

8精選課件A類感染性物質(zhì)的包裝與標(biāo)簽9精選課件臨床標(biāo)本的包裝（1）標(biāo)本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有橡及圈的塑料管里，擰緊。（2）將密閉后的標(biāo)本放入大小適合的塑料袋密封；每袋裝一份標(biāo)本。（3）在采樣管上用油性記號筆做好標(biāo)記用塑料袋密封。同時填寫人感染豬流感監(jiān)測病例標(biāo)本原始登記表，用另一塑料袋密封。（4）將標(biāo)本密封袋放入專用運輸箱內(nèi)，放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具有吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標(biāo)本，可以放在同一塑料袋內(nèi)再次做密封。所有容器必須有生物危險標(biāo)識。10精選課件臨床標(biāo)本運送、接收和保存根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》（國務(wù)院424號令）的有關(guān)規(guī)定，人禽流感標(biāo)本應(yīng)當(dāng)由不少于兩人的專人護送，并采取相應(yīng)的防護措施，不得通過公共電（汽）車和城市鐵路運輸。標(biāo)本接受不少于兩人，做好記錄，辦理相關(guān)接受手續(xù)。標(biāo)本保存應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４?1精選課件實驗室檢測決策流行早期階段重點在于控制和預(yù)防，此時高靈敏度的檢測手段（如流行株特異性核酸檢測）實優(yōu)先被選擇的，目的在于發(fā)現(xiàn)起始病例或病例群，以便能夠及時地進行抗病毒治療和制定相應(yīng)的預(yù)防策略。12精選課件實驗室檢測決策流感已經(jīng)廣泛流行期間此時的重點在于臨床病例的確認，進而防止在醫(yī)院內(nèi)進一步傳播擴散，因而此時實驗室檢測可以采用免疫熒光、快速抗原檢測（快診）等技術(shù)進行病理診斷，并且在有可能的情況下進行耐藥性檢測。

13精選課件禽流感(H5N1)病毒的檢測方法

核酸檢測抗體檢測病毒分離抗原檢測HIMNSRH細胞分離雞胚分離PCRMDDNASBAIFAELISA膠體金診斷快速；特異度高；靈敏度低；診斷快速；特異度高；靈敏度高；得不到病毒；特異度高；無法進行早期診斷；金標(biāo)準(zhǔn)；病毒可用于其它研究；需要較嚴格的實驗條件；14精選課件實驗室檢測方法推薦的檢測方法用Real-timeRT-PCR方法檢測豬流行性感冒（H1N1病毒）病毒。檢測A型流感病毒的M基因、Swine（H1N1）的HA基因和NP基因，以及質(zhì)控對照RNP基因確診豬流感病毒A/H1N1的唯一可靠的方法是進行病毒分離（病毒分離應(yīng)在BSL-3實驗室進行），并且進行部分/全基因測序。15精選課件其他檢測方法

快速流感抗原檢測可以區(qū)分A和B型流感病毒，不能區(qū)分亞型快速檢測實驗A型流感陽性的病例符合可能病例的標(biāo)準(zhǔn)但由于和其它檢測方法相比靈敏度較低，因此，快速檢測陰性結(jié)果可能是假陰性，不能作為豬流感感染的最后診斷。16精選課件快診方法的特點操作簡單快速（＜30min）教過容易判斷和解釋無儀器設(shè)備需求，可用于疫情現(xiàn)場檢測FluA和FluB不能進行亞型的鑒別17精選課件快診的應(yīng)用價值感染病例的處理：輔助流感病例的臨床治療策略和醫(yī)院處理方案的制定。爆發(fā)疫情的處理：有助于對爆發(fā)疫情的預(yù)防控制制度的建立。公共健康：在流感爆發(fā)期間，對于公共場所（如商業(yè)區(qū)、旅游區(qū)）的人群健康，快速診斷將提供有效的信息以供控制方案的制定，提供有效的公共健康建議。18精選課件快診的應(yīng)用價值監(jiān)測：為社會公眾提供流感活動情況的“早期預(yù)警”系統(tǒng)。在一些國家快速檢測已經(jīng)被應(yīng)用流感的監(jiān)測形成制度，被用于病毒分離前的標(biāo)本篩選。但是WHO要求對流感進行抗原分析，不推薦把快速檢測作為監(jiān)測的單一手段。19精選課件免疫熒光法免疫熒光試驗可以區(qū)分A和B型流感病毒。結(jié)果取決于臨床標(biāo)本的質(zhì)量，操作技能由于免疫熒光和其他免疫檢測方法中使用的抗體可能不會和該病毒的靶位點結(jié)合，因此會產(chǎn)生假陰性結(jié)果，不能作為豬流感感染的最后診斷。20精選課件PCR雖然在PCR方法中檢測流感基因的高度保守片段和確診A型流感的引物也許還可以使用，但目前PCR診斷試驗中用于A型流感病毒分型的引物可能不能檢測非人類病毒。21精選課件Real-TimePCR基本原理:指在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個RT-PCR進程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量或定性分析的方法.熒光基團主要有TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料TaqMan熒光探針工作原理:PCR擴增時,在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和淬滅熒光基團.探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,探針被酶切降解,報告基團和淬滅基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)接到熒光信號,每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步22精選課件23精選課件24精選課件25精選課件步驟1.病毒核酸提取:QIAGENRNeasyMiniKit(74104)1.100ul樣品+500ulRLT,混勻靜置5-10分鐘2.加入5UL巰基乙醇和600UL70℅的乙醇充分混勻3將Rnedsyminispin柱子置于干凈的2ML收集管，吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。4吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。5向柱子中加入700ULWashBufferRW1，12000rpm,離心15秒6從Kit中取一支干凈的2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，加入500ulWashBufferRPE（加入44ml無水乙醇），12000rpm,離心15秒7棄液，加入500ulWashBufferRPE液，13000-14000rpm,離心2分8將柱子移到1.5ml的EP管，加入50ulRnase—freeWater，靜置2分912000rpm,離心1分，收集離心液為提取的RNA，立即做實驗或-20℃保存26精選課件組分體積(ul)2xMasterMix12.5x(n+4)上游引物0.5x(n+4)下游引物0.5x(n+4)QuantiTectRTMix0.5x(n+4)probe0.5x(n+4)RNA5.0x(n+4)RNasefreewaterUpto25x(n+4)引物和探針4對：InfA，swInfA，swH1，RP反應(yīng)體系的配置

實驗步驟27精選課件反應(yīng)程序

50℃30