精子活力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)三精液品質(zhì)的感觀檢查精子活率、密度檢查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諜z查精子密度、活率的方法；熟悉感觀檢查精液品質(zhì)的方法。二、實(shí)驗(yàn)材料精液選用牛、羊、豬、馬、犬、兔任意一種動(dòng)物的新鮮精液。藥械用品顯微鏡、顯微鏡保溫箱(或顯微鏡恒溫臺(tái))、載玻片、蓋玻片、搪瓷盤(pán)、溫度計(jì)、滴管、擦鏡紙、紗布、蒸餾水、3%和0.9%氯化鈉溶液、2%煤酚皂溶液、1/3000新潔爾滅溶液、75%酒精。其他精子密度掛圖及有關(guān)圖表。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容精液的感觀檢查觀察測(cè)定下列各項(xiàng)結(jié)果并記入登記表內(nèi)。測(cè)定射精量將采得的精液倒入有刻度的試管或集精杯中，測(cè)量其容量。各家畜的射精量平均為：馬70(30—100)ml,驢50(10—80)ml,牛4(2—10)ml,羊1.0(0.7—2.0)ml,豬250(150—500)ml。色澤、氣味觀察觀察精液的色澤并嗅聞氣味。云霧狀的觀察觀察牛、羊精液翻騰滾動(dòng)的云霧狀態(tài),并按以下符號(hào)記入表內(nèi),云霧狀顯著者以“+++”表示,有云霧狀者以“++”表示,云霧狀不明顯或無(wú)云霧狀者以“+”表示。精子密度檢查及活率評(píng)分精子的密度取1小滴精液在清潔的載玻片上,加上蓋玻片,使精液分散成均勻一薄層,不得存留氣泡,也不能使精液外流或溢于蓋玻片上,置于顯微鏡下放大400—600倍觀察,按下列等級(jí)評(píng)定其密度。密——在整個(gè)視野中精子密度很大,彼此之間空隙很小,看不清楚各個(gè)精子運(yùn)動(dòng)的活動(dòng)情況,這一級(jí)屬于“密”,每毫升精液含精子數(shù)約在10億個(gè)以上,登記時(shí)記以“密”字。

中一一精子之間的空隙明顯，精子彼此之間的距離約有一個(gè)精子的長(zhǎng)度，有些精子的活動(dòng)情況可以清楚地看到。這種精液的密度評(píng)為“中”每毫升所含精子數(shù)約在2—10億個(gè)之間，登記時(shí)記以“中”字。稀一一精子分散于視野內(nèi)，精子之間的空隙超過(guò)一個(gè)精子的長(zhǎng)度，這種精液每毫升所含精子是在2億以下，登記時(shí)記以“稀”字。ABC牛精子密度示意圖A:密；B.中；C.稀精子的活率評(píng)定必須于采精后立刻在22—26°C的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，最好是在37°C保溫箱內(nèi)進(jìn)行，在評(píng)定精子活率的同時(shí)也可以測(cè)定精子的密度。用玻璃棒蘸取1滴原精液或經(jīng)稀釋的精液（馬、豬精液的精子密度低，可以不稀釋，而牛、羊精液的精子密度大，須用0.9%氯化鈉溶液或其他稀釋液進(jìn)行稀釋，其溫度須與精液溫度相近），滴在載玻片上，加上蓋玻片，其間應(yīng)充滿精液，不使氣泡存在，也可滴在蓋玻片上翻放于凹玻片的凹窩上，置于顯微鏡下放大250—400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺(tái)須懸滴法檢查精子活率S子的活動(dòng)有3種類型，即直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和振擺運(yùn)動(dòng)。評(píng)價(jià)精子的活率是根據(jù)直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的多少而定的，即：總精子數(shù)精子活率=呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)x100%總精子數(shù)目前評(píng)定精子活率等級(jí)的方法有兩種：十級(jí)制一一在顯微鏡視野中估測(cè)直線前運(yùn)動(dòng)精子所占全部精子的百分?jǐn)?shù)。直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子為100%者評(píng)為1.0級(jí)；90%者評(píng)定為0.9級(jí)；無(wú)直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的精液為'0"級(jí)。牛、羊的精液中由于副性腺分泌物少，精子密度大，因此，要求精液達(dá)到'密0.6”（即密度為“密”活率為“0.6”級(jí)）及“中0.8"級(jí)以上才能作為合格的精液。而馬、豬的精

液中副性腺分泌物多，精子密度小，因此正常的精液定為“中0.6”、“稀0.8”以上的等級(jí)。表1種公畜精液品質(zhì)檢查登記表畜別畜號(hào)米精時(shí)間（年月日）射精量（ml）色澤氣味云霧狀密度活率實(shí)驗(yàn)四精子數(shù)量計(jì)算和畸形率的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諟y(cè)定每毫升精液中所含精子數(shù)的方法，以及測(cè)定精子畸形率的操作要點(diǎn)。測(cè)定每一頭份冷凍精液內(nèi)有效精子數(shù)，以確定是否符合輸精要求。二、實(shí)驗(yàn)材料精液任一種公畜或雄性動(dòng)物的新鮮精液或冷凍精液。器械顯微鏡、載玻片、蓋玻片、紅細(xì)胞及白細(xì)胞稀釋管、血（色素）吸管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)、光電比色計(jì)、5ml試管、1ml及2ml吸管、玻棒、染色缸、染色架、玻片鑷、紗布。幾種染色液配方（1）0.5%龍膽紫0.5g 96%酒精100ml（2） 酒精固定液96%酒精87.5ml40%甲醛（福爾馬林）12.5ml96%酒精87.5ml（3）凡那他氏鍍銀染色液胡氏固定液福爾馬林2ml染色液胡氏固定液福爾馬林2ml染色液?jiǎn)螌幩?g硝酸銀溶液醋酸1ml石炭酸1g蒸餾水100ml蒸餾水100ml硝酸銀0.25g硝酸銀0.25g蒸餾水100ml4）威廉斯染色液品紅原液品紅10g 96%酒精100ml伊紅原液將伊紅溶于酒精中制成飽和溶液。染色液品紅原液10ml 5%石炭酸100ml取混合液50ml 伊紅原液25ml注：充分混合，至少放置14天后，經(jīng)過(guò)濾可用于精子染色。美藍(lán)原液美藍(lán)10g 酒精（96%）100ml畸形精子形態(tài)圖、血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)構(gòu)造圖三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）精子數(shù)量測(cè)定血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)測(cè)定法（1）清洗器械先將血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)及蓋玻片用蒸餾水沖洗，使其自然干燥。血吸管或紅細(xì)胞和白細(xì)胞稀釋管先用蒸餾水沖洗，再用95%酒精清洗，最后用乙醚清洗。試管及吸管洗凈后須經(jīng)烘干。（2）精液的稀釋用lml吸管準(zhǔn)確吸取3%NaCl0.2ml或2ml,注入小試管中。根據(jù)稀釋倍數(shù)的要求,再用血吸管吸出10ul或20ulNaCl溶液棄去。用血吸管或紅、白細(xì)胞稀釋管吸取精液至刻度10ul或20ul處。用紗布擦去吸管尖端附著的精液,將精液注入到小試管中。用拇指按住小試管口，振蕩2—3min使其混合均勻。（3）精子的計(jì)數(shù)將擦洗干凈的計(jì)算盤(pán)置于顯微鏡載物臺(tái)上,在計(jì)算室上蓋上蓋玻片。將試管中稀釋好的精液,滴一滴于計(jì)算室上蓋玻片的邊緣,使精液自動(dòng)滲入計(jì)算室。注意不要使精液溢出于蓋玻片之上,也不可因精液不足而致計(jì)算室內(nèi)有氣泡或干燥之處,如果出現(xiàn)有上述現(xiàn)象應(yīng)重新操作。靜置3min后以400—600倍顯微鏡檢查。統(tǒng)計(jì)出計(jì)算室的四角及中央共5個(gè)中方格即80小方格的精子數(shù)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)小方格內(nèi)的精子,只數(shù)小方格內(nèi)壓在左線和上線的精子。由5個(gè)中方格（80個(gè)小方格）所統(tǒng)計(jì)的精子數(shù)（X）代入下列公式即得出每毫升的精子數(shù)。X—X400X10X稀釋倍數(shù)X1000=每毫升精液所含精子數(shù)=XX50000x稀釋倍數(shù)80

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及計(jì)算順序和方法確定精液稀釋倍數(shù)可以按表1、2計(jì)算。表1精液稀釋倍數(shù)精液種類稀釋管種類吸取時(shí)所達(dá)到的刻度稀釋倍數(shù)精液3%NaCl牛羊紅細(xì)胞吸管0.51101101200200血吸管10Ul1990ul20020ul1980ul100豬馬白細(xì)胞吸管0.5111112010血吸管10Ul190ul2020ul180ul10表2精子濃度計(jì)算稀釋倍數(shù)應(yīng)乘常數(shù)稀釋倍數(shù)應(yīng)乘常數(shù)2001000萬(wàn)20100萬(wàn)100500萬(wàn)1050萬(wàn)為了減少誤差，必須進(jìn)行兩次精子計(jì)數(shù)，如果前后兩次誤差大于10%，則應(yīng)用第三次檢查。最后在3次檢查中取兩次誤差不超過(guò)10%的，求其平均數(shù)，即為所確定的精子數(shù)。光電比色計(jì)測(cè)定法常用的光電比色計(jì)有581—G型、72—1型和76—1型等。制備測(cè)定管，進(jìn)行被檢樣品的比色。（1）牛精液精子濃度的測(cè)定用2.9%等滲檸檬酸鈉液5ml，定點(diǎn)到100；取鮮精0.1ml加進(jìn)入另一個(gè)裝有4.9ml的2.9%檸檬酸鈉的比色皿中。如用581—G型比色計(jì)，要用42號(hào)藍(lán)色濾光片比色；如用72—1型比色計(jì)，要用440nm進(jìn)行比色，記錄其透光度和光密度值（X值）。同上另在測(cè)定管內(nèi)加1滴8mol的苛性鈉，同除去精清的密度記錄其透光度的光密

度。（2）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)計(jì)數(shù)，待測(cè)各鮮精樣品數(shù)批，每份樣品測(cè)兩次，如兩次誤差超過(guò)5%時(shí)需要重測(cè)。將兩次平均值作為該透光度（或光密度）溶液的密度。用牛精液測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)表3。二）直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的計(jì)算（精子活率的計(jì)算）方法基本和精子數(shù)量計(jì)算法相同，有以下幾點(diǎn)不同。用0.9%生理鹽水作為稀釋液，以保持活精子的正常動(dòng)動(dòng)。顯微鏡應(yīng)置于保溫箱內(nèi)，保持37—38°C。統(tǒng)計(jì)出4個(gè)角的4個(gè)及中央1個(gè)共5個(gè)方格中的非直線運(yùn)動(dòng)（包括死精子、擺動(dòng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)）的精子數(shù)，求出每毫升精液中非直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)。將計(jì)算盤(pán)放入120C的干燥箱中5min，利用高溫殺死全部精子后，計(jì)數(shù)4角及中央5個(gè)方格的精子數(shù)，求出每毫升精液中的總精子數(shù)。計(jì)算直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的百分率，即精子活率：精子活率總精子數(shù)-精子活率總精子數(shù)-非直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)

總精子數(shù)X100%表3奶牛、肉牛精子密度查數(shù)表透光度億/ml透光度億/ml透光度億/ml透光度億/ml透光度億/ml524.76412419.72514314.6789629.6363814.5937624.49812519.45614414.4135639.3709824.3283724.23332619.09074514.1481649.1055834.0629823.96792718.92534613.8827658.8401843.7975923.70252818.65994713.6173668.7547853.53211023.43712918.39454813.3519678.3093863.26671123.17173018.12914913.0865688.0439873.00131223.90633117.86375012.8211697.7785882.73591322.64093217.59835112.5557707.5131892.47051422.37553317.33295212.2903717.2477902.20511522.11013417.06755312.0249726.9823911.93971621.84473516.60215411.7595736.7169921.67431721.75933616.53675511.4941746.4515931.40891821.31393716.27135611.2287756.1861941.14351921.04853816.00595710.9633765.9207950.87812020.78313915.74095810.6979775.6553960.61272120.52774015.47515910.4325785.3890970.34372220.25234115.20976010.1671795.1745980.08192319.98694214.9443619.9017804.8591注：新鮮精液0.1ml+2.9%檸檬酸鈉4.9ml）（三）每頭份冷凍精液中有效精子數(shù)的測(cè)定隨機(jī)取一份精液，用常規(guī)方法解凍后，較準(zhǔn)確地評(píng)定出精子活率。在同一批冷凍精液中，再隨機(jī)取一份精液（取一粒顆粒冷凍精液直接投入小試管中,不需加解凍液）。在60—80°C熱水中經(jīng)數(shù)分鐘殺死全部精子，用1ml吸管準(zhǔn)確量取被檢精液，將測(cè)量過(guò)的精液依然注入到原試管內(nèi)。另取一支1ml吸管，準(zhǔn)確吸取2.9%檸檬酸鈉溶液，取用量為1ml精液/頭份，注入到精液試管中，充分混合均勻。這樣試管內(nèi)經(jīng)稀釋后的精液量即為1ml。取稀釋后的精液，滴入血細(xì)胞計(jì)算盤(pán)內(nèi)，計(jì)數(shù)5個(gè)方格中的精子數(shù)（設(shè)為X個(gè)）。按下列公式計(jì)算X（1） 精子數(shù)/ml=x400x10x100080或者以X個(gè)精子數(shù)直接乘以5萬(wàn)即為1ml稀釋后精液內(nèi)的精子數(shù)。（2） 精子數(shù)/頭份=精子數(shù)/mlX精液量（ml）/頭份（3） 有效精子數(shù)/頭份=精子數(shù)/頭份X精子活率（四）測(cè)定精子畸形率以細(xì)玻璃棒蘸取精液1滴，滴于載玻片一端，如系牛、羊精液應(yīng)再加1—2滴0.9%NaCl溶液。以另一載玻片的頂端呈35度角，抵于精液滴上，向另一端拉去，將精液均勻涂抹于載玻片上。抹片于空氣中自然干燥。拉向液滴，使玻璃片邊緣附著精液；3?將玻片推向另一端用下列任意一種方法固定染色。（1） 用0.5%龍膽紫酒精溶液染色3min，水洗、待干即可鏡檢，也可用藍(lán)墨水染色。（2） 置于酒精固定液中固定5—6min,取出以水沖洗后，陰干或烘干，用藍(lán)墨水染色3—5min,再用水沖洗，使之干燥后于顯微鏡下檢查。（3） 凡那他氏鍍銀法將自然干燥的抹片，以胡氏溶液滴在玻片上固定1min，水洗10s，將染色劑滴在玻片上，慢慢加熱至發(fā)生蒸氣為止，用水洗30s后，再加上0.25%硝酸銀2—3滴，立即滴上1滴氨水，抹片左右搖動(dòng)，則產(chǎn)生混濁的黃褐色，再放在酒精燈上慢慢加熱，經(jīng)20s，直至發(fā)出水蒸汽的“白霧”狀為止，最后再進(jìn)行水洗，待干后便可鏡檢。威廉斯染法將自然干燥的抹片放入無(wú)水酒精中固定4min,然后移入0.5%氯胺T(Chloramine-T)中浸2min左右，直到抹片上的粘液物質(zhì)被除掉而變得