柞樹提取液遺傳毒性的研究

柞樹提取液遺傳毒性的研究

棕櫚葉是指經(jīng)過(guò)加工的次生林木本植物。它有多種用途，在中國(guó)廣泛分布。柞樹提取液也有相當(dāng)?shù)尼t(yī)用價(jià)值,對(duì)治療魚類黑斑及體表各種潰爛有特效,而對(duì)治療人的燒傷、燙傷、外傷以及動(dòng)物咬傷有奇效,且無(wú)遺留瘢痕,對(duì)昆蟲咬傷、青春痘以及其他原因引起的人表皮炎癥性、感染性和化膿性疾病也有顯著療效。柞樹提取液作為一種新產(chǎn)品,需要對(duì)其安全性進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)。本研究采用小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)、Ames實(shí)驗(yàn)和V79基因突變實(shí)驗(yàn)對(duì)柞樹提取液的遺傳毒性進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1材料和實(shí)驗(yàn)儀器組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97,TA98,TA100和TA102,由原衛(wèi)生部食品檢驗(yàn)所提供,本實(shí)驗(yàn)室保存。柞樹提取液(Bristletoothoakextract)采取燃燒柞樹樹枝,排出的氣體冷凝回收,再經(jīng)發(fā)酵后蒸餾提取而成,為水溶性成分,由杭州001生物科技有限公司提供;中國(guó)倉(cāng)鼠肺(V79)細(xì)胞株由中科院細(xì)胞庫(kù)提供;0.25%胰酶溶液Ⅸ(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司);Hyclone磷酸鹽緩沖液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);Hyclone改良型RPMI1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);甲基磺酸乙酯和6-巰基鳥嘌呤由Sigma公司提供;代謝活化劑大鼠肝勻漿S-9混合液,營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基,底層、頂層培養(yǎng)基等都是在本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)配現(xiàn)用。其他試劑均為分析純。凈化工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shecab公司);倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司);CYT-1000型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(浙江省科學(xué)器材進(jìn)出口責(zé)任有限公司);電熱恒溫水槽(上海森倍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);5810R型高速離心機(jī)(德國(guó)埃本德公司);SS-325型高壓滅菌器(日本Tomy公司);MDF-U32V型低溫冰箱(德國(guó)Sanyo公司)等。組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97,TA98,TA100和TA102,由原衛(wèi)生部食品檢驗(yàn)所提供,本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2溫度、濕度ICR小鼠,由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2008-0033,清潔級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量25～35g。溫度20～23℃,相對(duì)濕度55%～70%。小鼠實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)3d。染毒前,禁食過(guò)夜,不限制飲水。1.3全覆蓋回變菌落實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用平板摻入法。用4株菌株的非代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試,在柞樹提取液100mg(為標(biāo)準(zhǔn)最高劑量的20倍)時(shí)未出現(xiàn)毒性作用。故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇柞樹提取液6.25,12.5,25,50和100mg。最高劑量用原液直接測(cè)試,其他劑量分別稱取樣品原液625,1250,2500和5000mg加滅菌蒸餾水至10ml,充分混勻,實(shí)驗(yàn)時(shí)每培養(yǎng)皿加0.1ml。同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(蒸餾水)和2-氨基芴陽(yáng)性對(duì)照組,每種菌株每個(gè)測(cè)試濃度設(shè)三皿平行,在加S9和不加S9條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回變菌落數(shù)。有陽(yáng)性結(jié)果重復(fù)測(cè)試一次。1.4集落形成率測(cè)定參照GB15193.12-2003。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用10g·L-1(相當(dāng)于每瓶細(xì)胞加100mg,為標(biāo)準(zhǔn)最高劑量的20倍)作為最高濃度。柞樹提取液2.5,5.0和10g·L-1組10μl培養(yǎng)液中分別加入柞樹提取液25,50和100mg,同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組(不含血清的培養(yǎng)液)和甲基磺酸乙酯(EMS)陽(yáng)性對(duì)照組(終濃度0.4g·L-1)。直接觀察集落數(shù),并按下列公式計(jì)算:絕對(duì)集落形成率=形成集落數(shù)/接種集落數(shù)×100%;相對(duì)集落形成率=絕對(duì)集落形成率(實(shí)驗(yàn))/絕對(duì)集落形成率(對(duì)照)×100%;突變頻率=(突變集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×(1/絕對(duì)集落形成率)。1.5環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照參照GB15193.5-2003。小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分成5組,每組10只。小鼠ig給予柞樹提取液2.5,5.0和10.0g·kg-1,第1次給藥后24h再給予1次,觀察30h。另設(shè)正常對(duì)照(蒸餾水)和環(huán)磷酰胺60mg·kg-1(陽(yáng)性對(duì)照)組。給藥后6h脫頸椎處死,每只小鼠取兩側(cè)股骨髓,制片,細(xì)胞涂片置顯微鏡下觀察,每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞,計(jì)算微核千分率(‰)。柞樹提取液組與對(duì)照組相比,微核率有明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),即可確認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。1.6小鼠精子畸形試驗(yàn)參照GB15193.7-2003。另取小鼠25只,雄性,隨機(jī)分成5組,每組5只。小鼠ig給予柞樹提取液2.5,5.0和10.0g·kg-1組(按10ml·kg-1給藥,蒸餾水配制),每天1次,連續(xù)5d,另設(shè)正常對(duì)照(蒸餾水)和絲裂霉素C2.0mg·kg-1陽(yáng)性對(duì)照組。小鼠最后給藥30d后脫頸椎處死,取出其雙側(cè)附睪放入生理鹽水離心管中,制片,高倍鏡下檢查精子形態(tài),每只小鼠檢查完整精子1000個(gè),記錄畸變精子類型(如無(wú)鉤、胖頭、香蕉狀、雙頭尾、折疊和無(wú)定形)和數(shù)目,計(jì)算精子畸形率(%)。精子畸形陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)是畸形率至少為陰性對(duì)照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性意義,并有劑量反應(yīng)關(guān)系。1.7統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示。應(yīng)用軟件SPSS15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用秩和檢驗(yàn)和泊松(Poisson)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果2.1回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果柞樹提取液Ames的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,可見柞樹提取液不同劑量在加S9和不加S9條件下的回變菌落數(shù)均未超過(guò)溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍,Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。2.2率50%以上的實(shí)驗(yàn)要求柞樹提取液V79基因突變實(shí)驗(yàn)各組集落形成率見表2,受試物各組集落形成率均較陰性對(duì)照低,但滿足細(xì)胞成活率50%以上的實(shí)驗(yàn)要求。柞樹提取液V79基因突變實(shí)驗(yàn)各組突變頻率如表3,陽(yáng)性對(duì)照突變頻率為陰性對(duì)照的5倍以上,而柞樹提取液組突變頻率均未達(dá)到陰性對(duì)照組3倍以上的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),其中,柞樹提取液2.5和10mg加S9的與不加S9的組相對(duì)于陰性對(duì)照組的突變頻率的比值均在1.5以上,但未見明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。2.3棕櫚提取物對(duì)大鼠骨細(xì)胞微核率的影響柞樹提取液小鼠微核率如表4所示,用泊松檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì),柞樹提取液各劑量組微核率和陰性對(duì)照組,差異均無(wú)顯著性,小鼠微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。2.4小鼠精子畸形試驗(yàn)柞樹提取液小鼠精子畸形率如表5所示,柞樹提取液各劑量組精子畸形率和陰性對(duì)照組比較,經(jīng)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì),差異均無(wú)顯著性,提示小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。3小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)和v7基因突變實(shí)驗(yàn)隨著遺傳毒理學(xué)相關(guān)領(lǐng)域特別是分子生物學(xué)的研究進(jìn)展,遺傳毒性測(cè)試評(píng)價(jià)方法也在不斷改進(jìn)。據(jù)報(bào)道,目前已建立的短期檢測(cè)法已超過(guò)200種,但真正經(jīng)過(guò)驗(yàn)證有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。根據(jù)其檢測(cè)的遺傳學(xué)終點(diǎn)可分為4種類型:①檢測(cè)基因突變,②檢測(cè)染色體畸變,③檢測(cè)染色體組畸變,④檢測(cè)DNA原始損傷。其中,遺傳毒性最常規(guī)的檢測(cè)方法有小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)和Ames實(shí)驗(yàn)等。小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)的遺傳學(xué)終點(diǎn)上屬于檢測(cè)染色體畸變實(shí)驗(yàn),而小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)屬于基因突變實(shí)驗(yàn)。柞樹提取液的精子畸形率和小鼠微核率實(shí)驗(yàn)顯示各劑量組與對(duì)照組相比,差異均無(wú)顯著性,表明未見柞樹提取液對(duì)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞有遺傳毒性。此外,PCE/RBC作為細(xì)胞毒性的指標(biāo),比值小于0.1提示對(duì)骨髓具有明顯的抑制作用,應(yīng)降低受試物劑量,重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究中各劑量組PCE/RBC均大于0.6,符合標(biāo)準(zhǔn)要求。Ames實(shí)驗(yàn)根據(jù)遺傳學(xué)終點(diǎn)分屬于基因突變,它是檢測(cè)環(huán)境誘變劑一組實(shí)驗(yàn)中的首選實(shí)驗(yàn),廣泛應(yīng)用于致突變化學(xué)物的初篩。預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示100mg劑量條件下未見抑菌現(xiàn)象,故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇6.25,12.5,25,50和100mg組進(jìn)行,結(jié)果以直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出回變菌落數(shù)的多少而定,如在背景生長(zhǎng)良好的條件下,受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上(即回變菌落數(shù)等于或大于2乘以未處理對(duì)照數(shù)),并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測(cè)試點(diǎn)有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng),即可認(rèn)為該受試物誘變實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。本研究結(jié)果顯示雖然最高劑量為每皿100mg在加S9的條件下TA102回變菌落有些偏高,但所有劑量組均未達(dá)到溶劑對(duì)照組的2倍升高的標(biāo)準(zhǔn),因此結(jié)果為陰性。V79基因突變實(shí)驗(yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)是真核細(xì)胞基因突變,在近些年來(lái)常被應(yīng)用于評(píng)價(jià)新產(chǎn)品的安全性,也常用于遺傳毒理學(xué)研究和篩選誘變劑工作。根據(jù)突變集落數(shù),計(jì)算突變率以判定受試物的致突變性。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,染毒劑量為10.0g·L-1條件下培養(yǎng)的V79細(xì)胞顯示有較多的死亡的現(xiàn)象,以此為最高劑量下設(shè)2.5和5.0g·L-1進(jìn)行V79基因突變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示陰性對(duì)照集落形成率在90%以上,最高劑量集落形成率在50%以上,表明本研究劑量設(shè)置滿足V79基因突變實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)要求。陽(yáng)性對(duì)照的突變率顯著高于陰性對(duì)照,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。當(dāng)突變率為自發(fā)突變率的3倍或3倍以上,或至少3個(gè)濃度范圍內(nèi),突變率有隨濃度升高而增加的劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí),可判為陽(yáng)性。本研究最高突變率為2.2,除低劑量組在加S9條件下突變率低于陰性對(duì)照組外,其余各劑量組均高于陰性對(duì)照組,但未見明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系,因此本研究結(jié)果未達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。在一定的